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【其他】pcr产物直接测序后结果比对问题 已有3人参与
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做菌种鉴定时，用PCR产物直接测序， 细菌使用通用引物PCR，双向测序得到1100bp左右的PCR产物的正反向两条序列，现在有几个问题哈 1、正反向两条序列如何拼接？是不是需要正反向拼接了才能blast比对呀？还是单链就可以？哪种处理准确性好呢？ 2、序列比对：网上说法是得到的测序结果全部都放到blast里去，老师告诉我说序列比对时要找保守序列，比如在所得序列中查找GGCGG或者GCAGC这样的结构，然后掐头去尾再去比对，不知道序列比对时候的具体操作是什么啊？ 3、我看很多说法是 克隆测序 ，这与直接测序有哪些区别啊？ 4、以上问题有什么参考资料可以借鉴啊？ 谢谢各位虫有解答我心中的疑惑 |
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3楼2010-08-19 18:07:44
xp198766
铁杆木虫 (著名写手)
小木虫职业打酱油滴~~！
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小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+3):欢迎分享经验~~ 2010-08-17 11:54:35
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1、首先，你要把正反序列拼接成一条序列，再去比对，要不，你测序的信息就没有利用完全，双向测序得到的两条序列，你先看峰图，把那些很乱的部分要去掉，峰图很乱说明测序不准，去掉很乱的部分之后，一般一条序列长度应该为700-800bp左右（一个反应的测序精度一般为700bp） 2、我想你是问如何拼接是吧？你们老师应该是告诉你如何拼接序列，原理就是，先让两条序列正反向一致（如果你是双向测序的话，一般是把一条序列变成反向互补序列就行了），两条序列肯定会有重复，一般是a的前端与b的后端重复（或a的后端与b的前端重复），选择a的前端的部分序列与b的后端比对，找到重复，再将别的序列连接在重复的两端（第二种情况也一样），不知道你清楚不，就是双向测序的话，中间肯定有重复的，找到重复就行了…… 拼接好序列后，直接到NCBI里面的BLAST里面，选择BLASTn，物种选others，默认设置就可以了…… 3、克隆测序的话，可以将pcr得到的结果序列全测出来，直接纯化测序的话，两端的序列，可能有50bp左右会测不准（峰图较乱），还有克隆测序的话，由于是转到质粒里面，序列是纯的，pcr有可能有杂带污染 4、上面是我个人经验，参考资料不清楚 [ Last edited by xp198766 on 2010-8-17 at 09:20 ] |
2楼2010-08-17 09:19:16
4楼2017-05-22 19:23:07
