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黎亚丽

新虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】如何提高PET表达系统的蛋白表达量 已有13人参与

宿主菌:BL21(DE3)
表达载体:PET-28a
目的蛋白:63KD
IPTG:终浓度为1mM
诱导温度是:37度
转速:200rmp
请大家多多指教,做了好几次都没有见效果。
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dcb005

金虫 (著名写手)

★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
amisking(金币+2):欢迎交流! 2010-08-02 21:40:30
楼主做的是最适条件,不表达可能是位置或者基因的问题
建议你看看是不是在上清里,若上清包涵体都没有,考虑一下你的基因有没有信号肽,会不会分泌到胞外
TCA确定胞外再没有,就是基因问题,换表达体系
★穷则独善其身,达则兼济天下★
6楼2010-08-02 21:17:21
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dcb005

金虫 (著名写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by 黎亚丽 at 2010-08-03 09:43:57:

我查了一下我的基因中有信号肽,分泌到哪我还没有查到,请指教。

用signalP预测一下。另外一个就是参考一下pet 操作手册。上面有蛋白分泌定位的操作方法
★穷则独善其身,达则兼济天下★
13楼2010-08-03 09:52:21
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dcb005

金虫 (著名写手)

★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
reasonspare(金币+2):谢谢分享。 2010-08-05 06:03:30
引用回帖:
Originally posted by 黎亚丽 at 2010-08-03 09:09:33:

你说的是不是上清和沉淀都得用SDS-PAGE检测呢?还有怎么看基因信号肽?信号肽和蛋白分泌到胞外有关系吗啊?TCA是什么意思?

有的蛋白可溶在上清中,有的表达量太高在包涵体中,信号肽可用singnal P预测,TCA是浓缩蛋白的方法,比如要是分泌到胞外,培养基太多,蛋白PAGE根本看不出来,需要浓缩再测蛋白
★穷则独善其身,达则兼济天下★
14楼2010-08-03 09:55:03
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