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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】求助：那种方法提取RNA浓度比较高？
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zzq770204

至尊木虫 (著名写手)

[交流] 【求助/交流】求助：那种方法提取RNA浓度比较高？ 已有13人参与

本人拟构建个均一化cDNA文库，需要的RNA量比较多，因此需要比较高的浓度。采用安比奥的试剂盒提取出的RNA浓度太低了，在逆转录和扩增时间的PCR次数太多了，难以满足要求。但是看别人用TRzol抽提由于时间长，很容易降解。请问哪种方法或试剂盒比较好？麻烦指点下，谢谢！

[ Last edited by zzq770204 on 2010-7-29 at 21:18 ]
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1楼 2010-07-21 10:46:04
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zhangzhuang

银虫 (初入文坛)
zzq770204(金币+6): 2010-07-22 14:36:50
你的引物，还有扩增条件的优化
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2楼2010-07-21 11:43:11
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won7

金虫 (小有名气)
zzq770204(金币+10): 2010-07-22 14:36:35
“扩增后纯化”是什么意思？是actin扩增后纯化吗？如果是的话，那多半是你的纯化试剂或步骤有问题。clontech构建未剪切文库让公司帮忙，3万元基本可以搞定。
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3楼2010-07-21 11:43:53
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sunyongle1

木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★
amisking(金币+4):鼓励交流！ 2010-07-21 18:08:00
zzq770204(金币+10): 2010-07-22 14:36:11
不见得是RNA的问题，RNA只要降解不是很厉害，就能满足普通的反转录，扩个Actin还是没有问题的。但是如果要建库，就要保证RNA的质量和反转录的质量。
你们实验室不缺钱的话，还是交给公司吧。也就两三万，自己做很费劲，质量也很难保证。
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4楼2010-07-21 14:57:54
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香菱儿

铁杆木虫 (著名写手)
★
看天(金币+1):鼓励交流 2010-07-22 12:14:14
zzq770204(金币+10): 2010-07-22 14:36:03
clontech的这个试剂盒没用过。
能否具体描述一下呢？
（1）total RNA应该电泳检测的，如果再纯化mRNA的话，也应该电泳及分光光度法检测，RNA总量有多少，以及质量好坏应该能判断吧。
（2）对逆转录的产物进行扩增，用的是通用引物吗？采用纯化试剂盒纯化，然后割胶回收吗？
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漫洒英雄泪，相离处士家。谢慈悲剃度在莲台下。没缘法转眼分离乍。赤条条来去无牵挂。那里讨烟蓑雨笠卷单行？一任俺芒鞋破钵随缘化！
5楼2010-07-22 12:02:00
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winscavin

木虫 (正式写手)
zzq770204(金币+3): 2010-07-23 08:48:22
实在不行就测序看看吧
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6楼2010-07-22 21:03:59
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super1998

金虫 (小有名气)
★ ★
zzq770204(金币+10):你是试剂公司还是？ 2010-07-24 20:17:18
zzq770204(金币+10): 2010-07-30 12:54:51
lstt09nk(金币+2):鼓励交流~~ 2010-08-02 17:18:22
首先不明白你扩增目的基因后为什么要纯化？扩完了可以直接电泳。
如果反转录可以扩增ACTIN，说明模板质量还行，但是没看到你的RNA，也不知道你的材料来源，因此无法确定能否满足建库的要求。
我给你几个建议，如果你的CDNA模板量足够大，可以选择1-2lu跑个电泳看看。如果看到清晰弥散条带，那就是扩增环节的问题，跟你的模板无关了。
试试看用其他模板是否可以扩增？修改一下你的PCR条件，特别是退火温度。
找公司做文库，犯不上，现在这个已经很普及了，如果实验室有钱可以选择，毕竟省事，我们这边5K-2w不等，看你要多大的文库了。
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123
7楼2010-07-24 15:37:38
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super1998

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by super1998 at 2010-07-24 15:37:38:
首先不明白你扩增目的基因后为什么要纯化？扩完了可以直接电泳。
如果反转录可以扩增ACTIN，说明模板质量还行，但是没看到你的RNA，也不知道你的材料来源，因此无法确定能否满足建库的要求。
我给你几个建议，如 ...

我是学生，呵呵，我得意思是我们学校这边，公司是这个价格。
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123
8楼2010-07-25 20:52:30
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super1998

金虫 (小有名气)
★ ★
reasonspare(金币+2):你的诚恳的帖子，值得我诚恳的加分。 2010-07-31 05:12:39
zzq770204(金币+10): 2010-07-31 22:48:04
引用回帖:
Originally posted by zzq770204 at 2010-07-21 10:46:04:
本人拟构建个均一化cDNA文库，需要的RNA量比较多，因此需要比较高的浓度。采用安比奥的试剂盒提取出的RNA浓度太低了，在逆转录和扩增时间的PCR次数太多了，难以满足要求。但是看别人用TRzol抽提由于时间长，很容易 ...

呵呵，先谢谢你的金币，这个帖子，无需金币，我也可以回答你。对于提大量RNA,目前已知的就是TRIZOL了，这个方法用的最广，最经典，至于你说的时间长降解，只要你按步骤完成，降解一点没关系的。你是要抽提什么材料的RNA？不同材料，提取差异化很大，有些组织容易提，有些植物的就很难提，包括材料的复杂程度，是否多糖，多沉淀，等等，都是考虑的因素。但是总体而言，TRIZOL是最好的方法了。可是多试几次，掌握方法就可以。不难的
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123
9楼2010-07-31 02:50:01
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szxy520

木虫 (著名写手)
zzq770204(金币+6): 2010-07-31 22:48:10
用TRzol可以了吧
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10楼2010-07-31 07:10:58
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