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hgt832

铜虫 (初入文坛)

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NaCl 法）,提取的DNA是否为细菌总DNA? 非� 已有10人参与

您好：

我需要提取革兰氏阳性菌的总DNA(包括染色体DNA和质粒DNA)。我在网上查到细菌基因组DNA的提取法（CTAB/NaCl 法）,请问这种方法提的是总DNA的吗？(包括染色体DNA和质粒DNA) （下面附有这种方法步骤）

细菌基因组DNA包括染色体DNA和质粒DNA吗？还是细菌基因组DNA只指染色体DNA？

我用这种方法提了DNA，用染色体DNA上的引物进行PCR,灵敏度很高，而用质粒DNA上的引物进行PCR，灵敏度却很低。开始我怀疑是引物的问题，用碱法专门提取了质粒的DNA,用质粒DNA上的引物进行PCR，灵敏度变得很高。说明不是引物的问题，而是细菌基因组DNA的提取法（CTAB/NaCl 法）的问题，这种方法提的质粒DNA浓度太低。我困惑的是网上有说这种方法是可以提细菌总DNA的(包括染色体DNA和质粒DNA)，但是我做的结果是这种方法提的质粒DNA浓度太低，根本满足不了实验要求。这种方法到底提的是总DNA的吗？还是提的是染色体DNA?

附：细菌基因组DNA的提取法（CTAB/NaCl 法）

1. 将菌株接种于液体LB培养基，37℃震荡培养过夜。
2. 取1.5ml培养物12000rpm离心2min。
3. 沉淀物加入567 ul的TE缓冲液，反复吹打使之重新悬浮，加入30ul 10%SDS和15ul的蛋白酶K，混匀，于37℃温育1h.
4. 加入100ul 5mol/L NaCl, 充分混匀，再加入80ul CTAB/NaCl溶液，混匀后再65℃温育10min。
5. 加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混匀，离心4-5min, 将上清转入一只新管中，加入0.6-0.8倍体积的异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，沉淀可稍加离心。
6. 沉淀用1ml的70%乙醇洗涤后，离心弃乙醇．

非常期待并感谢感谢您的回答！

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1楼 2010-07-14 12:05:06

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dorecnu

木虫 (正式写手)

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1.基因组DNA 是指菌体的总DNA，和质粒无关。
2.CTAB/NaCl 法目的主要是为了去除某些样品中的多糖而设计。
3.楼主说了很多，没明白实验设计的目的，请告之。
4.很清楚的是，如果你用提取总DNA的方法，不管是CTAB/NaCl ，还是普通酚氯仿抽提的方法，质粒DNA当然都是会被抽提出来的。但是用提取质粒DNA的方法，基因组DNA基本上会被去除干净。
5.建议楼主：A：想提细菌DNA，用酚氯仿法手工抽提，或使用试剂盒，革兰氏阳性菌务必使用溶菌酶，PK,SDS破细胞壁，10ml菌液因该可以得到很好的抽提效果，记住酚氯仿抽提需抽提至无白色中间层为止，然后加入3M乙酸钠，乙醇沉淀DNA,最后在用乙醇沉淀法纯化，但是如果菌体中有质粒，会残余微量，你用PCR检测因其灵敏度极高，所以会有条带。
B:想提质粒，直接上柱纯化试剂盒，同样建议P1前使用溶菌酶，PK,SDS破壁。