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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】AFLP的产物片段大
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狄林

银虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】AFLP的产物片段大 已有4人参与

最近做AFLP的预扩产物在200-2000bp,选扩产物从200到2000以上均有拖带,在大板上是颜色比较深的拖带,没有明显条带.以前同一连接产物预扩产物在100-1500bp,选扩产物从200到750.
做过如下尝试:换了内切酶,引物,接头,连接酶;mg离子减小到0.8;将酶用量加大一倍,时间延长到14h;预扩退火温度提高到58度;延伸时间都从2分减到1分;可选扩产物片段还是在2000左右.
敬请高手指点.谢谢!
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1楼 2010-06-16 01:03:53
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xyls6868

新虫 (小有名气)
狄林(金币+1): 2010-06-18 13:00:48
引用回帖:
Originally posted by 狄林 at 2010-06-16 01:03:53:
最近做AFLP的预扩产物在200-2000bp,选扩产物从200到2000以上均有拖带,在大板上是颜色比较深的拖带,没有明显条带.以前同一连接产物预扩产物在100-1500bp,选扩产物从200到750.
做过如下尝试:换了内切酶,引物,接头, ...

拖带的话，有可能是胶有问题
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2楼2010-06-17 14:26:50
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xyls6868

新虫 (小有名气)
狄林(金币+1): 2010-06-18 13:00:52
产物片段大的话，有可能是因为酶切不完全造成的吧
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3楼2010-06-17 15:33:11
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lansha8331

无虫 (小有名气)
狄林(金币+1): 2010-06-18 13:01:06
标准的应该是，预扩100-1000bp，应该很集中的吧，你的范围有点大，说明你的预扩有问题，或者预扩之前的操作就已经有了问题，建议重新从酶切开始做
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4楼2010-06-17 16:38:10
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狄林

银虫 (小有名气)
我重新酶切，时间增加到10h,酶量也都是4U，单酶切做了一下，都能切了，在1500以下弥散，连接接头Mse 15pmol, EcorI 5pmol，DNA也重新检测了，也没问题。
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5楼2010-06-18 13:06:15
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
★
dhd997(金币+1):谢谢交流。 2010-06-18 14:39:36
狄林(金币+3): 2010-06-18 20:41:54
首先你的预扩大小就不对，说明应该是之前的步骤出了问题，单酶切都可以切开，但是双酶切时buffer变化了，是否切开了呢？我认为问题还是出在酶切上，关键还是酶，从目前的大小判断，可能出现问题的是多酶切位点的那个酶，不知道你用的是不是MseI，这个酶切不动，主要考虑酶本身、buffer和BSA，至于时间，这个不重要
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6楼2010-06-18 14:28:28
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狄林

银虫 (小有名气)
我用的mseI,ferments的,双酶切用的tango buffer,单切也用的是这个buffer.麻烦您指点现在该怎么办呀.MseI加大酶量和时间好象作用不大.
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7楼2010-06-18 20:48:24
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狄林

银虫 (小有名气)
我用的mseI,ferments的,双酶切用的tango buffer,单切也用的是这个buffer.麻烦您指点现在该怎么办呀.MseI加大酶量和时间好象作用不大.
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8楼2010-06-18 20:49:03
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
狄林(金币+1): 2010-06-19 13:43:06
我当时用的是酶切连接同时进行的，直接使用的T4连接酶的buffer
但是你这个tango buffer的方法我也听说过，应该没有问题
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9楼2010-06-18 22:10:11
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lansha8331

无虫 (小有名气)
狄林(金币+1): 2010-06-23 13:16:40
我也用过这两个双酶切组合：MseI和EcorI ，哪个Buffer忘记了，看两个酶的说明书吧，他们有个共用的buffer，对彼此单酶切都影响不大的那个Buffer，好像就是tango buffer。。。酶切越久，切的片段越碎吧，这样对实验结果有利还是无利啊，我当时就切了两个多小时，我用的两种酶分步酶切的，每种酶切各两个多小时
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10楼2010-06-21 15:58:58
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