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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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狄林

银虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】AFLP的产物片段大 已有4人参与

最近做AFLP的预扩产物在200-2000bp,选扩产物从200到2000以上均有拖带,在大板上是颜色比较深的拖带,没有明显条带.以前同一连接产物预扩产物在100-1500bp,选扩产物从200到750.
做过如下尝试:换了内切酶,引物,接头,连接酶;mg离子减小到0.8;将酶用量加大一倍,时间延长到14h;预扩退火温度提高到58度;延伸时间都从2分减到1分;可选扩产物片段还是在2000左右.
敬请高手指点.谢谢!
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xyls6868

新虫 (小有名气)

狄林(金币+1): 2010-06-18 13:00:48
引用回帖:
Originally posted by 狄林 at 2010-06-16 01:03:53:
最近做AFLP的预扩产物在200-2000bp,选扩产物从200到2000以上均有拖带,在大板上是颜色比较深的拖带,没有明显条带.以前同一连接产物预扩产物在100-1500bp,选扩产物从200到750.
做过如下尝试:换了内切酶,引物,接头, ...

拖带的话,有可能是胶有问题
2楼2010-06-17 14:26:50
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xyls6868

新虫 (小有名气)

狄林(金币+1): 2010-06-18 13:00:52
产物片段大的话,有可能是因为酶切不完全造成的吧
3楼2010-06-17 15:33:11
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lansha8331

无虫 (小有名气)

狄林(金币+1): 2010-06-18 13:01:06
标准的应该是,预扩100-1000bp,应该很集中的吧,你的范围有点大,说明你的预扩有问题,或者预扩之前的操作就已经有了问题,建议重新从酶切开始做
4楼2010-06-17 16:38:10
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狄林

银虫 (小有名气)

我重新酶切,时间增加到10h,酶量也都是4U,单酶切做了一下,都能切了,在1500以下弥散,连接接头Mse 15pmol, EcorI 5pmol,DNA也重新检测了,也没问题。
5楼2010-06-18 13:06:15
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yujiaping1

木虫 (著名写手)


dhd997(金币+1):谢谢交流。 2010-06-18 14:39:36
狄林(金币+3): 2010-06-18 20:41:54
首先你的预扩大小就不对,说明应该是之前的步骤出了问题,单酶切都可以切开,但是双酶切时buffer变化了,是否切开了呢?我认为问题还是出在酶切上,关键还是酶,从目前的大小判断,可能出现问题的是多酶切位点的那个酶,不知道你用的是不是MseI,这个酶切不动,主要考虑酶本身、buffer和BSA,至于时间,这个不重要
6楼2010-06-18 14:28:28
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狄林

银虫 (小有名气)

我用的mseI,ferments的,双酶切用的tango buffer,单切也用的是这个buffer.麻烦您指点现在该怎么办呀.MseI加大酶量和时间好象作用不大.
7楼2010-06-18 20:48:24
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狄林

银虫 (小有名气)

我用的mseI,ferments的,双酶切用的tango buffer,单切也用的是这个buffer.麻烦您指点现在该怎么办呀.MseI加大酶量和时间好象作用不大.
8楼2010-06-18 20:49:03
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yujiaping1

木虫 (著名写手)

狄林(金币+1): 2010-06-19 13:43:06
我当时用的是酶切连接同时进行的,直接使用的T4连接酶的buffer
但是你这个tango buffer的方法我也听说过,应该没有问题
9楼2010-06-18 22:10:11
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lansha8331

无虫 (小有名气)

狄林(金币+1): 2010-06-23 13:16:40
我也用过这两个双酶切组合:MseI和EcorI ,哪个Buffer忘记了,看两个酶的说明书吧,他们有个共用的buffer,对彼此单酶切都影响不大的那个Buffer,好像就是tango buffer。。。酶切越久,切的片段越碎吧,这样对实验结果有利还是无利啊,我当时就切了两个多小时,我用的两种酶分步酶切的,每种酶切各两个多小时
10楼2010-06-21 15:58:58
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