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狄林

银虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】AFLP的产物片段大 已有4人参与

最近做AFLP的预扩产物在200-2000bp,选扩产物从200到2000以上均有拖带,在大板上是颜色比较深的拖带,没有明显条带.以前同一连接产物预扩产物在100-1500bp,选扩产物从200到750.
做过如下尝试:换了内切酶,引物,接头,连接酶;mg离子减小到0.8;将酶用量加大一倍,时间延长到14h;预扩退火温度提高到58度;延伸时间都从2分减到1分;可选扩产物片段还是在2000左右.
敬请高手指点.谢谢!
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lansha8331

无虫 (小有名气)

狄林(金币+1): 2010-06-23 13:16:40
我也用过这两个双酶切组合:MseI和EcorI ,哪个Buffer忘记了,看两个酶的说明书吧,他们有个共用的buffer,对彼此单酶切都影响不大的那个Buffer,好像就是tango buffer。。。酶切越久,切的片段越碎吧,这样对实验结果有利还是无利啊,我当时就切了两个多小时,我用的两种酶分步酶切的,每种酶切各两个多小时
10楼2010-06-21 15:58:58
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xyls6868

新虫 (小有名气)

狄林(金币+1): 2010-06-18 13:00:48
引用回帖:
Originally posted by 狄林 at 2010-06-16 01:03:53:
最近做AFLP的预扩产物在200-2000bp,选扩产物从200到2000以上均有拖带,在大板上是颜色比较深的拖带,没有明显条带.以前同一连接产物预扩产物在100-1500bp,选扩产物从200到750.
做过如下尝试:换了内切酶,引物,接头, ...

拖带的话,有可能是胶有问题
2楼2010-06-17 14:26:50
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xyls6868

新虫 (小有名气)

狄林(金币+1): 2010-06-18 13:00:52
产物片段大的话,有可能是因为酶切不完全造成的吧
3楼2010-06-17 15:33:11
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lansha8331

无虫 (小有名气)

狄林(金币+1): 2010-06-18 13:01:06
标准的应该是,预扩100-1000bp,应该很集中的吧,你的范围有点大,说明你的预扩有问题,或者预扩之前的操作就已经有了问题,建议重新从酶切开始做
4楼2010-06-17 16:38:10
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