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【求助/交流】为什么内切酶总是切不开我的DNA已有11人参与
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| 为什么内切酶总是切不开我的DNA，我用了好多种酶进行酶切，但是最后还是切不开，是怎么回事啊？请哪位高手指点一下。 |
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liyong1981 
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2楼2010-05-31 11:10:35
goodwish
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3楼2010-05-31 11:16:47
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fungixx
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5楼2010-05-31 11:33:08
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amisking(金币+4):good！ 2010-05-31 12:50:34
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amisking(金币+4):good！ 2010-05-31 12:50:34
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影响因素很多： 下面是一道考研题及答案，请参考。 影响限制性内切核酸酶活性的因素 1 DNA纯度 在DNA样品中若含有蛋白质，或没有去除干净制备过程中所用的乙醇、EDTA、SDS、酚、氯仿和某些高浓度金属离子，均会降低限制酶的催化活性，甚至使限制酶不起作用。 2 核酸内切限制酶的缓冲液 核酸内切限制酶的标准缓冲液包括氯化镁、氯化钠或氯化钾、Tris-HCL、巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT)以及牛血清白蛋白(BSA)等。 使用所有限制酶均可发挥活性的一种缓冲液。 不同限制性内切酶对NaCl浓度的要求不同，这是不同限制酶缓冲液组成上的一个主要的不同。据此可分为高盐、中盐和低盐缓冲液，在进行双酶解或多酶解时，若这些酶切割可在同种缓冲液中作用良好，则几种酶可同时酶切；若这些酶所要求的缓冲液有所不同，可采用以下三种方法进行消化反应：先用要求低盐缓冲液的限制性内切酶消化DNA，然后补足适量的NaCl，再用要求高盐缓冲液的限制酶消化； 先用一种酶进行酶解，然后用乙醇沉淀酶解产物，再重悬于另一缓冲液中进行第二次酶解。 3 酶切消化反应的温度 DNA消化反应的温度，是影响限制内切酶活性的一个重要因素。不同的核酸内切限制酶，具有各自的最适反应温度。多数限制内切酶的最适反应温度是37℃，少数限制性内切酶的最适反应温度高于或低于37℃。 4 DNA的分子结构 DNA分子构型对核酸内切限制酶的活性有很大影响，如消化超螺旋的DNA比消化线性DNA用酶量要高出许多倍。 有些限制酶在消化它们自己的处于不同部位的限制位点，其效率也有明显差异。 限制性内切酶反应的终止 通常是采用65℃条件下温浴5min； 加终止反应液（如0.5mol/L的EDTA使之在溶液中的终浓度达到10 mol/L）螯合Mg2+，以终止反应。 |
6楼2010-05-31 12:13:26
天空与飞鸟
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7楼2010-05-31 13:04:57
8楼2010-05-31 13:24:31
ben1147
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小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
scelab(金币+5):正解~~~ 2010-05-31 22:36:07
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
scelab(金币+5):正解~~~ 2010-05-31 22:36:07
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氯仿抽提两次怎么会还有很多蛋白呢？吸上清的时候吸到中间层了？ 酚:氯仿抽提完以后要拿氯仿单独抽一次，把水相中残余的酚抽提掉（苯酚微溶于水） 如果确认样品里蛋白多的话，用蛋白酶K消化一下，再用酚氯仿、氯仿抽提。 感觉提DNA的步骤可能有问题，不应该有这么多蛋白的。前面提取的步骤里有没有用溶菌酶或者蛋白酶？ 另外乙醇沉淀以后75%乙醇洗的时候尽量把沉淀悬起来，再多泡一会，还可以洗两次，每次都要把上次残余的液体吸干净，尽量把盐离子除的干净一点，防止影响酶切体系的离子浓度 [ Last edited by ben1147 on 2010-5-31 at 15:24 ] |
9楼2010-05-31 15:21:37
10楼2010-05-31 15:22:39