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曹艳辉

新虫 (初入文坛)

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[交流] 【求助/交流】为什么内切酶总是切不开我的DNA已有11人参与

为什么内切酶总是切不开我的DNA，我用了好多种酶进行酶切，但是最后还是切不开，是怎么回事啊？请哪位高手指点一下。

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KAMA-what done is done！

1楼2010-05-31 11:01:32

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ququr008

金虫 (小有名气)

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★ ★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
amisking(金币+4):good！ 2010-05-31 12:50:34

影响因素很多：

下面是一道考研题及答案，请参考。

影响限制性内切核酸酶活性的因素

1 DNA纯度
在DNA样品中若含有蛋白质，或没有去除干净制备过程中所用的乙醇、EDTA、SDS、酚、氯仿和某些高浓度金属离子，均会降低限制酶的催化活性，甚至使限制酶不起作用。

2 核酸内切限制酶的缓冲液
核酸内切限制酶的标准缓冲液包括氯化镁、氯化钠或氯化钾、Tris-HCL、巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT)以及牛血清白蛋白(BSA)等。
使用所有限制酶均可发挥活性的一种缓冲液。
不同限制性内切酶对NaCl浓度的要求不同，这是不同限制酶缓冲液组成上的一个主要的不同。据此可分为高盐、中盐和低盐缓冲液，在进行双酶解或多酶解时，若这些酶切割可在同种缓冲液中作用良好，则几种酶可同时酶切；若这些酶所要求的缓冲液有所不同，可采用以下三种方法进行消化反应：先用要求低盐缓冲液的限制性内切酶消化DNA，然后补足适量的NaCl，再用要求高盐缓冲液的限制酶消化；
先用一种酶进行酶解，然后用乙醇沉淀酶解产物，再重悬于另一缓冲液中进行第二次酶解。

3 酶切消化反应的温度
DNA消化反应的温度，是影响限制内切酶活性的一个重要因素。不同的核酸内切限制酶，具有各自的最适反应温度。多数限制内切酶的最适反应温度是37℃，少数限制性内切酶的最适反应温度高于或低于37℃。

4 DNA的分子结构
DNA分子构型对核酸内切限制酶的活性有很大影响，如消化超螺旋的DNA比消化线性DNA用酶量要高出许多倍。
有些限制酶在消化它们自己的处于不同部位的限制位点，其效率也有明显差异。
限制性内切酶反应的终止通常是采用65℃条件下温浴5min；
加终止反应液（如0.5mol/L的EDTA使之在溶液中的终浓度达到10 mol/L）螯合Mg2+，以终止反应。