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proteinwang

铜虫 (正式写手)

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[交流] 【求助/交流】考马斯亮兰法（Bradford法）测定蛋白浓度事宜请教！已有7人参与

前段时间做考马斯亮兰法（Bradford法）测定蛋白浓度时，测定OD595nm处的值比较低，现向大家请教一下在此试验过程中的注意事项。
1、考马斯亮兰G―250染料试剂的配制过程中，考马斯亮兰G―250必须先溶于95%的乙醇后，再添加85%的磷酸，最后定容吗？是不是可以把考马斯亮兰G―250，95%的乙醇和85%的磷酸一块放到容器中，然后溶解后定容呢？
2、用1.0mg/ml的标准蛋白质溶液给各试管分别加入：0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，然后用无离子水补充到0.1ml。最后各试管中分别加入5.0ml考马斯亮兰 G―250试剂，每加完一管，立即在旋涡混合器上混合，5min后测定其OD595，测得值比较低，且基本没有规律性，不知道是什么原因？
请成功做过相关实验的高手给予解答！

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1楼2010-04-30 16:38:20

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weiyanbme

木虫 (正式写手)

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★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+2):欢迎回来多多交流~~ 2010-04-30 20:30

引用回帖:

Originally posted by proteinwang at 2010-04-30 16:38:20:
前段时间做考马斯亮兰法（Bradford法）测定蛋白浓度时，测定OD595nm处的值比较低，现向大家请教一下在此试验过程中的注意事项。
1、考马斯亮兰G―250染料试剂的配制过程中，考马斯亮兰G―250必须先溶于95%的乙醇 ...

看你的过程应该是在比色皿里做的，我是用酶标仪做的，直接在96孔板里做，你的方案我在网上也找到过，最后再96孔板里做的，也不是很好，后来把总体积减少了，200μl的染液，30μl的蛋白溶液，测得的结果线性还是不错的；当然有时候你做出趋势曲线后，发现要测得的蛋白浓度无法计算，就是说你的稀释度还要降低，所以一般最少要做个0.1以及1.0的标准曲线
另外，我配制的染液根本没定容，直接用量筒量取体积数，做的结果线性还是不错的，最后的浓度也跟我用其他的方法相差不大；
建议再做一次，本来这个方法就不是很精确的，看看文献，多是BCA法，为什么不出现这个方法呢？想想就明白了，这个方法也就平时做起来简单些，要发paper还是的得试剂盒了