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proteinwang

铜虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】考马斯亮兰法（Bradford法）测定蛋白浓度事宜请教！ 已有7人参与

前段时间做考马斯亮兰法（Bradford法）测定蛋白浓度时，测定OD595nm处的值比较低，现向大家请教一下在此试验过程中的注意事项。
1、考马斯亮兰G―250染料试剂的配制过程中，考马斯亮兰G―250必须先溶于95%的乙醇后，再添加85%的磷酸，最后定容吗？是不是可以把考马斯亮兰G―250，95%的乙醇和85%的磷酸一块放到容器中，然后溶解后定容呢？
2、用1.0mg/ml的标准蛋白质溶液给各试管分别 加入：0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，然后用无离子水补充到0.1ml。最后各试管中分别加入5.0ml考马斯亮兰 G―250试剂，每加完一管，立即在旋涡混合器上混合，5min后测定其OD595，测得值比较低，且基本没有规律性，不知道是什么原因？
请成功做过相关实验的高手给予解答！
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1楼 2010-04-30 16:38:20
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lihan7296

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
是不是蛋白含量低了？
我是用0.1mg/mL 的蛋白溶液，每次加0.1-1mL做标曲

[ Last edited by lihan7296 on 2010-4-30 at 19:43 ]
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seizetheday
2楼2010-04-30 19:41:33
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weiyanbme

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+2):欢迎回来多多交流~~ 2010-04-30 20:30
引用回帖:
Originally posted by proteinwang at 2010-04-30 16:38:20:
前段时间做考马斯亮兰法（Bradford法）测定蛋白浓度时，测定OD595nm处的值比较低，现向大家请教一下在此试验过程中的注意事项。
1、考马斯亮兰G―250染料试剂的配制过程中，考马斯亮兰G―250必须先溶于95%的乙醇 ...

看你的过程应该是在比色皿里做的，我是用酶标仪做的，直接在96孔板里做，你的方案我在网上也找到过，最后再96孔板里做的，也不是很好，后来把总体积减少了，200μl的染液，30μl的蛋白溶液，测得的结果线性还是不错的；当然有时候你做出趋势曲线后，发现要测得的蛋白浓度无法计算，就是说你的稀释度还要降低，所以一般最少要做个0.1以及1.0的标准曲线
另外，我配制的染液根本没定容，直接用量筒量取体积数，做的结果线性还是不错的，最后的浓度也跟我用其他的方法相差不大；
建议再做一次，本来这个方法就不是很精确的，看看文献，多是BCA法，为什么不出现这个方法呢？想想就明白了，这个方法也就平时做起来简单些，要发paper还是的得试剂盒了
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3楼2010-04-30 19:44:11
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richujs

木虫 (正式写手)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+1):感谢交流~~ 2010-05-01 21:16
1.行不行你多配一份，小分量的，对照一下就行
2.我记得生化实验里边说过考马斯亮兰法有两个线性范围，1～10，10～100微克每毫升，蛋白溶液的体积和染液的比例为1：4，你做的是1：50
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思想是能力和力量的源泉
4楼2010-05-01 10:32:34
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marc0907

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
前一段时间，我做的也不是很好啊！同样请教
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5楼2010-05-02 13:05:50
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da1234mao

铁虫 (著名写手)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
wanhscn(金币+1): 鼓励应助！ 2012-01-06 01:07:24
磷酸不好做，我用高氯酸做的，比较好，不是蛋白浓度的问题，貌似是你没有摇匀，塞上塞子后颠倒要好一些啊，
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6楼2012-01-05 23:22:08
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stone1060

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
2楼: Originally posted by lihan7296 at 2010-04-30 19:41:33
是不是蛋白含量低了？
我是用0.1mg/mL 的蛋白溶液，每次加0.1-1mL做标曲

请问加标准蛋白的梯度是如何设置的？我用的也是0.1mg/mL 的蛋白溶液，设的梯度是0.2,0.4,0.6,0.8，1.0，但是线性不是很好，最高也只有0.97，求指导~
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没事儿傻乐观，不靠谱的90后~
7楼2013-07-03 14:52:10
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山村老师

铜虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我用的是试剂盒，2.0mg/ml的标准品先用tris梯度稀释：0.125、0.25、0.5、1、1.5，有的时候加上0.0625.
然后按照样品1:40的比例样和试剂，做出的曲线R平方值基本在0.99往上。10-150ug线性比较好
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8楼2014-01-03 10:52:14
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