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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】以cDNA为模板PCR扩增目的片段时条带较浅原因
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wq4125

铜虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】以cDNA为模板PCR扩增目的片段时条带较浅原因 已有3人参与

已经扩增出目的片段，是不是模板量有问题，50ul体系模板量大概为2.5ug
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1楼 2010-03-12 16:26:48
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
wq4125(金币+2):谢谢，上胶图了，准备再试试 2010-03-13 00:07
能上个图看看吗？
有可能跟模板量有关系，稍微多加一点试试，另外引物多加一点，带就亮了，但是可能会有非特异性扩增，退火温度适当降低也会有效

[ Last edited by yujiaping1 on 2010-3-12 at 16:53 ]
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2楼2010-03-12 16:49:32
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wq4125

铜虫 (小有名气)
上胶图
前4个为一个产物大概800bp，后4个为一个产物，大概400bp
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3楼2010-03-13 00:05:25
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michaelwuqingyu

金虫 (正式写手)
wq4125(金币+1): 2010-03-14 00:54
用cDNA聚合酶走的比较慢 建议延长延伸时间
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4楼2010-03-13 00:14:36
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spiderboy

金虫 (正式写手)
wq4125(金币+1): 2010-03-13 12:48
模板浓度低，目的序列拷贝数低，可以把片段回收后，再扩
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5楼2010-03-13 10:19:30
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
wq4125(金币+1): 2010-03-13 12:48
同意楼上，模板浓度低
另外有引物带，说明引物的浓度足够了
降低一下退火温度试试
胶的质量好像也一般，marker看起来一般，稍微有点模糊
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6楼2010-03-13 10:50:18
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阳光金鱼唐

金虫 (著名写手)
我也遇到了这种情况，可能是模板浓度低吧，像这种不亮的带回收是收不到什么东西的，我试过了，要增加模板浓度再扩。还有，可能是你跑电泳时样点少了。
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不知道什么是生活了，也不知道生活是什么了
7楼2010-03-14 17:27:37
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mourning

木虫 (正式写手)
这位置是目标条带吗？
愿意很多，也许RNA就质量不高，也许引物设计有问题等等，有阳性对照码？
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8楼2010-03-14 21:06:20
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wq4390

新虫 (初入文坛)
模板浓度低，目的序列拷贝数低
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9楼2010-03-18 19:04:46
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yang0071

木虫 (职业作家)
聚焦没聚好，图模糊
你就按照这个条件直接增加循环数，加上5次左右就够了，有时间的话，加10个循环
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10楼2010-03-18 19:54:02
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