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wq4125

铜虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】以cDNA为模板PCR扩增目的片段时条带较浅原因 已有3人参与

已经扩增出目的片段,是不是模板量有问题,50ul体系模板量大概为2.5ug
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yujiaping1

木虫 (著名写手)

wq4125(金币+2):谢谢,上胶图了,准备再试试 2010-03-13 00:07
能上个图看看吗?
有可能跟模板量有关系,稍微多加一点试试,另外引物多加一点,带就亮了,但是可能会有非特异性扩增,退火温度适当降低也会有效

[ Last edited by yujiaping1 on 2010-3-12 at 16:53 ]
2楼2010-03-12 16:49:32
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wq4125

铜虫 (小有名气)

上胶图
前4个为一个产物大概800bp,后4个为一个产物,大概400bp
3楼2010-03-13 00:05:25
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michaelwuqingyu

金虫 (正式写手)

wq4125(金币+1): 2010-03-14 00:54
用cDNA聚合酶走的比较慢 建议延长延伸时间
4楼2010-03-13 00:14:36
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spiderboy

金虫 (正式写手)

wq4125(金币+1): 2010-03-13 12:48
模板浓度低,目的序列拷贝数低,可以把片段回收后,再扩
5楼2010-03-13 10:19:30
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yujiaping1

木虫 (著名写手)

wq4125(金币+1): 2010-03-13 12:48
同意楼上,模板浓度低
另外有引物带,说明引物的浓度足够了
降低一下退火温度试试
胶的质量好像也一般,marker看起来一般,稍微有点模糊
6楼2010-03-13 10:50:18
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阳光金鱼唐

金虫 (著名写手)

我也遇到了这种情况,可能是模板浓度低吧,像这种不亮的带回收是收不到什么东西的,我试过了,要增加模板浓度再扩。还有,可能是你跑电泳时样点少了。
不知道什么是生活了,也不知道生活是什么了
7楼2010-03-14 17:27:37
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mourning

木虫 (正式写手)

这位置是目标条带吗?
愿意很多,也许RNA就质量不高,也许引物设计有问题等等,有阳性对照码?
8楼2010-03-14 21:06:20
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wq4390

新虫 (初入文坛)

模板浓度低,目的序列拷贝数低
9楼2010-03-18 19:04:46
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yang0071

木虫 (职业作家)

聚焦没聚好,图模糊
你就按照这个条件直接增加循环数,加上5次左右就够了,有时间的话,加10个循环
10楼2010-03-18 19:54:02
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