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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 目的基因连接T载体 菌落pcr没有目的条带
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三只0小猪仔

新虫 (初入文坛)

[求助] 目的基因连接T载体 菌落pcr没有目的条带 已有3人参与

我PCR产物连接T载体，做蓝白斑筛选，都是白斑，挑但菌落，做菌落pcr，没有目的条带，难道都是假阳性吗？我菌落pcr引物跟目的基因一样 求指教

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1楼 2019-06-02 15:26:23
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眺望爱

铜虫 (初入文坛)
你的pcr引物跟目的基因一样是无法从pcr来断定是否为假阳性的，推荐用载体上的插入位点前后一段200-300bp的基因做引物，这样可以判断是否为假阳性。然后蓝白斑筛选其实有一些感受态有表达缺陷，比如说jm110,在加了显色剂的平板上也不显色的。

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目标：生物的星辰大海！！！！
3楼2019-06-02 18:33:35
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普通回帖

花鸟画夜

新虫 (初入文坛)
是假阳性

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2楼2019-06-02 15:51:44
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三只0小猪仔

新虫 (初入文坛)
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3楼: Originally posted by 眺望爱 at 2019-06-02 18:33:35
你的pcr引物跟目的基因一样是无法从pcr来断定是否为假阳性的，推荐用载体上的插入位点前后一段200-300bp的基因做引物，这样可以判断是否为假阳性。然后蓝白斑筛选其实有一些感受态有表达缺陷，比如说jm110,在加了显 ...

那我要重新设计引物吗？还是多挑几个菌试一试，是PCR没有P出来吗？还是根本就没有连接上？

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4楼2019-06-03 07:31:58
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xinxiyuzhou

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
有可能都是假阳性，如果目的基因插入，不会所有的克隆没有目的条带的，可以多鉴定几个。另外，为什么要连T载呢？另外，没有做阳性对照吗？PU19的对照？
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5楼2019-06-03 08:02:05
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眺望爱

铜虫 (初入文坛)
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5楼: Originally posted by xinxiyuzhou at 2019-06-03 08:02:05
有可能都是假阳性，如果目的基因插入，不会所有的克隆没有目的条带的，可以多鉴定几个。另外，为什么要连T载呢？另外，没有做阳性对照吗？PU19的对照？

题主菌检的引物是目的基因上的，用空载体也是扩不出来的，所以没有做对照吧。

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目标：生物的星辰大海！！！！
6楼2019-06-03 08:38:40
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眺望爱

铜虫 (初入文坛)
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4楼: Originally posted by 三只0小猪仔 at 2019-06-03 07:31:58
那我要重新设计引物吗？还是多挑几个菌试一试，是PCR没有P出来吗？还是根本就没有连接上？
...

如果在你的感受态下空载体确定会显蓝斑而且没有涂错板子的话，建议先在基因插入位点前后100bp左右找两条引物合一下，毕竟这个载体以后可能还会再用的嘛。这个基因引物如果也没有条带就可以盲送试一下，如果扩出来是空载大小就要重做，建议首尾加重组臂做重组，效率会很高，平连效率还挺低的。

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三只0小猪仔
目标：生物的星辰大海！！！！
7楼2019-06-03 08:45:41
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三只0小猪仔

新虫 (初入文坛)
送红花一朵
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7楼: Originally posted by 眺望爱 at 2019-06-03 08:45:41
如果在你的感受态下空载体确定会显蓝斑而且没有涂错板子的话，建议先在基因插入位点前后100bp左右找两条引物合一下，毕竟这个载体以后可能还会再用的嘛。这个基因引物如果也没有条带就可以盲送试一下，如果扩出来是 ...

我是用的TA克隆，cDNA作为模版进行PCR扩增获得目的基因，回收纯化之后连接的T载体，PCR产物是带A尾的，做了阳性对照。是T载体购买时自带的，按操作连接之后转化的大肠杆菌，菌落PCR的引物与目的基因一样，实验室之前也是直接用的一样的引物 ，不知道哪里出了问题，还麻烦您指教一下

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8楼2019-06-03 11:23:40
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A913162220

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

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这种小实验，多挑几个点就行，用M13F和R引物PCR
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9楼2019-06-03 16:28:52
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三只0小猪仔

新虫 (初入文坛)
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9楼: Originally posted by A913162220 at 2019-06-03 16:28:52
这种小实验，多挑几个点就行，用M13F和R引物PCR

所以是菌落pcr引物不行吗？ 那我重新合成一条再试试？

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10楼2019-06-03 20:06:52
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