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目的基因连接T载体 菌落pcr没有目的条带 已有3人参与
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我PCR产物连接T载体，做蓝白斑筛选，都是白斑，挑但菌落，做菌落pcr，没有目的条带，难道都是假阳性吗？我菌落pcr引物跟目的基因一样 求指教 @飞约疯人院 发自小木虫IOS客户端 |
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你的pcr引物跟目的基因一样是无法从pcr来断定是否为假阳性的，推荐用载体上的插入位点前后一段200-300bp的基因做引物，这样可以判断是否为假阳性。然后蓝白斑筛选其实有一些感受态有表达缺陷，比如说jm110,在加了显色剂的平板上也不显色的。 发自小木虫Android客户端 |
3楼2019-06-02 18:33:35
2楼2019-06-02 15:51:44
4楼2019-06-03 07:31:58
xinxiyuzhou
至尊木虫 (著名写手)
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5楼2019-06-03 08:02:05
6楼2019-06-03 08:38:40
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如果在你的感受态下空载体确定会显蓝斑而且没有涂错板子的话，建议先在基因插入位点前后100bp左右找两条引物合一下，毕竟这个载体以后可能还会再用的嘛。这个基因引物如果也没有条带就可以盲送试一下，如果扩出来是空载大小就要重做，建议首尾加重组臂做重组，效率会很高，平连效率还挺低的。 发自小木虫Android客户端 |
» 本帖已获得的红花（最新10朵）
7楼2019-06-03 08:45:41
送红花一朵 |
我是用的TA克隆，cDNA作为模版进行PCR扩增获得目的基因，回收纯化之后连接的T载体，PCR产物是带A尾的，做了阳性对照。是T载体购买时自带的，按操作连接之后转化的大肠杆菌，菌落PCR的引物与目的基因一样，实验室之前也是直接用的一样的引物 ，不知道哪里出了问题，还麻烦您指教一下  发自小木虫IOS客户端 |
8楼2019-06-03 11:23:40
A913162220
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9楼2019-06-03 16:28:52
10楼2019-06-03 20:06:52