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三只0小猪仔

新虫 (初入文坛)

[求助] 目的基因连接T载体 菌落pcr没有目的条带已有3人参与

我PCR产物连接T载体,做蓝白斑筛选,都是白斑,挑但菌落,做菌落pcr,没有目的条带,难道都是假阳性吗?我菌落pcr引物跟目的基因一样 求指教

@飞约疯人院 发自小木虫IOS客户端
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眺望爱

铜虫 (初入文坛)

引用回帖:
5楼: Originally posted by xinxiyuzhou at 2019-06-03 08:02:05
有可能都是假阳性,如果目的基因插入,不会所有的克隆没有目的条带的,可以多鉴定几个。另外,为什么要连T载呢?另外,没有做阳性对照吗?PU19的对照?

题主菌检的引物是目的基因上的,用空载体也是扩不出来的,所以没有做对照吧。

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目标:生物的星辰大海!!!!
6楼2019-06-03 08:38:40
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花鸟画夜

新虫 (初入文坛)

2楼2019-06-02 15:51:44
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眺望爱

铜虫 (初入文坛)

你的pcr引物跟目的基因一样是无法从pcr来断定是否为假阳性的,推荐用载体上的插入位点前后一段200-300bp的基因做引物,这样可以判断是否为假阳性。然后蓝白斑筛选其实有一些感受态有表达缺陷,比如说jm110,在加了显色剂的平板上也不显色的。

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目标:生物的星辰大海!!!!
3楼2019-06-02 18:33:35
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三只0小猪仔

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 眺望爱 at 2019-06-02 18:33:35
你的pcr引物跟目的基因一样是无法从pcr来断定是否为假阳性的,推荐用载体上的插入位点前后一段200-300bp的基因做引物,这样可以判断是否为假阳性。然后蓝白斑筛选其实有一些感受态有表达缺陷,比如说jm110,在加了显 ...

那我要重新设计引物吗?还是多挑几个菌试一试,是PCR没有P出来吗?还是根本就没有连接上?

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4楼2019-06-03 07:31:58
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