应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 目的基因连接T载体 菌落pcr没有目的条带
121/2返回列表12下一页
查看: 4954  |  回复: 11
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

三只0小猪仔

新虫 (初入文坛)

[求助] 目的基因连接T载体 菌落pcr没有目的条带 已有3人参与

我PCR产物连接T载体，做蓝白斑筛选，都是白斑，挑但菌落，做菌落pcr，没有目的条带，难道都是假阳性吗？我菌落pcr引物跟目的基因一样 求指教

@飞约疯人院 发自小木虫IOS客户端
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2019-06-02 15:26:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

眺望爱

铜虫 (初入文坛)
你的pcr引物跟目的基因一样是无法从pcr来断定是否为假阳性的，推荐用载体上的插入位点前后一段200-300bp的基因做引物，这样可以判断是否为假阳性。然后蓝白斑筛选其实有一些感受态有表达缺陷，比如说jm110,在加了显色剂的平板上也不显色的。

发自小木虫Android客户端
赞一下(1人) 回复此楼
目标：生物的星辰大海！！！！
3楼2019-06-02 18:33:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

花鸟画夜

新虫 (初入文坛)
是假阳性

发自小木虫IOS客户端
回复此楼
2楼2019-06-02 15:51:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

三只0小猪仔

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 眺望爱 at 2019-06-02 18:33:35
你的pcr引物跟目的基因一样是无法从pcr来断定是否为假阳性的，推荐用载体上的插入位点前后一段200-300bp的基因做引物，这样可以判断是否为假阳性。然后蓝白斑筛选其实有一些感受态有表达缺陷，比如说jm110,在加了显 ...

那我要重新设计引物吗？还是多挑几个菌试一试，是PCR没有P出来吗？还是根本就没有连接上？

发自小木虫IOS客户端
赞一下 回复此楼
4楼2019-06-03 07:31:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xinxiyuzhou

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
有可能都是假阳性，如果目的基因插入，不会所有的克隆没有目的条带的，可以多鉴定几个。另外，为什么要连T载呢？另外，没有做阳性对照吗？PU19的对照？
赞一下 回复此楼
5楼2019-06-03 08:02:05
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

眺望爱

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by xinxiyuzhou at 2019-06-03 08:02:05
有可能都是假阳性，如果目的基因插入，不会所有的克隆没有目的条带的，可以多鉴定几个。另外，为什么要连T载呢？另外，没有做阳性对照吗？PU19的对照？

题主菌检的引物是目的基因上的，用空载体也是扩不出来的，所以没有做对照吧。

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
目标：生物的星辰大海！！！！
6楼2019-06-03 08:38:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

眺望爱

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 三只0小猪仔 at 2019-06-03 07:31:58
那我要重新设计引物吗？还是多挑几个菌试一试，是PCR没有P出来吗？还是根本就没有连接上？
...

如果在你的感受态下空载体确定会显蓝斑而且没有涂错板子的话，建议先在基因插入位点前后100bp左右找两条引物合一下，毕竟这个载体以后可能还会再用的嘛。这个基因引物如果也没有条带就可以盲送试一下，如果扩出来是空载大小就要重做，建议首尾加重组臂做重组，效率会很高，平连效率还挺低的。

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼

» 本帖已获得的红花（最新10朵）

三只0小猪仔
目标：生物的星辰大海！！！！
7楼2019-06-03 08:45:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

三只0小猪仔

新虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
7楼: Originally posted by 眺望爱 at 2019-06-03 08:45:41
如果在你的感受态下空载体确定会显蓝斑而且没有涂错板子的话，建议先在基因插入位点前后100bp左右找两条引物合一下，毕竟这个载体以后可能还会再用的嘛。这个基因引物如果也没有条带就可以盲送试一下，如果扩出来是 ...

我是用的TA克隆，cDNA作为模版进行PCR扩增获得目的基因，回收纯化之后连接的T载体，PCR产物是带A尾的，做了阳性对照。是T载体购买时自带的，按操作连接之后转化的大肠杆菌，菌落PCR的引物与目的基因一样，实验室之前也是直接用的一样的引物 ，不知道哪里出了问题，还麻烦您指教一下

发自小木虫IOS客户端
赞一下 回复此楼
8楼2019-06-03 11:23:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

A913162220

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
这种小实验，多挑几个点就行，用M13F和R引物PCR
赞一下 回复此楼
9楼2019-06-03 16:28:52
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

三只0小猪仔

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by A913162220 at 2019-06-03 16:28:52
这种小实验，多挑几个点就行，用M13F和R引物PCR

所以是菌落pcr引物不行吗？ 那我重新合成一条再试试？

发自小木虫IOS客户端
赞一下 回复此楼
10楼2019-06-03 20:06:52
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 三只0小猪仔 的主题更新
121/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 求b区学校调剂 +3 周56 2026-03-11 3/150 2026-03-13 16:20 by JourneyLucky
[考研] 材料与化工求调剂一志愿 985 总分 295 +6 dream…… 2026-03-12 6/300 2026-03-13 14:57 by JourneyLucky
[考研] 285求调剂 +4 ytter 2026-03-12 4/200 2026-03-13 14:48 by jxchenghu
[考研] 328化工专硕求调剂 +4 。，。，。，。i 2026-03-12 4/200 2026-03-13 14:44 by JourneyLucky
[考研] 材料与化工085600调剂求老师收留 +8 jiaanl 2026-03-11 8/400 2026-03-13 11:17 by houyaoxu
[考研] 材料与化工 323 英一+数二+物化，一志愿：哈工大 本人本科双一流 +3 自由的_飞翔 2026-03-13 4/200 2026-03-13 10:47 by 冠c哥
[考研] 求材料调剂 +3 隔壁陈先生 2026-03-12 3/150 2026-03-13 10:20 by 学员8dgXkO
[考研] 315求调剂 +6 小羊小羊_ 2026-03-11 7/350 2026-03-13 08:58 by Linda Hu
[考博] 2026年博士申请 +3 QwQwQW10 2026-03-11 3/150 2026-03-12 17:58 by gxch43
[考研] 288求调剂085600材料与化工 +14 Daunrin 2026-03-07 16/800 2026-03-12 16:19 by songkelly
[考研] 材料与化工304求B区调剂 +4 邱gl 2026-03-11 5/250 2026-03-11 23:15 by lyyia@@
[考研] 301求调剂 +5 Liyouyumairs 2026-03-11 5/250 2026-03-11 20:43 by ms629
[考博] 读博申请 +5 感dd 2026-03-10 7/350 2026-03-11 17:02 by QGZDSYS
[考研] 一志愿浙江大学0856材料与化工求调剂 +3 yansheng@211 2026-03-09 4/200 2026-03-11 10:52 by @飒飒飒飒
[考研] 调剂 +5 调剂的考研学生 2026-03-09 5/250 2026-03-10 22:13 by peike
[考研] 313分生物学求调剂 +5 Yyt杨1 2026-03-09 7/350 2026-03-10 18:58 by 清风月
[考研] 0817一志愿苏州大学280复试调剂 +9 kk扛 2026-03-07 9/450 2026-03-10 14:20 by peike
[考研] 295复试调剂 +4 简木ChuFront 2026-03-09 4/200 2026-03-09 21:49 by wangjihu
[考博] 26年博士申请 +4 科研狗111 2026-03-07 4/200 2026-03-08 21:56 by 0611517sll
[教师之家] 交大前校长王树国：现在最先进的科技并不在大学实验室，而是在企业研究院 +4 zju2000 2026-03-08 6/300 2026-03-08 19:15 by zju2000
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭