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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 点突变半年了还没出来。。求助。。
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eloi2017

新虫 (初入文坛)

[交流] 点突变半年了还没出来。。求助。。已有4人参与

要突变启动子上一个位点，试了酶切连接，NEB的HiFi Assembly，定点突变，用过TOP10F'和NEB 10ß做转化，每次不是不长就是WT。。

比如这次，俩片断PCR完了跑胶看没问题，俩片断和质粒酶切完胶回收也都ok，然后连接完长出来还是WT。。想不明白这WT是哪儿来的，按说体系里应该没有了啊。。

求各位大神指点迷津。。
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1楼2018-01-30 16:50:50
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drwhoknowss

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10楼: Originally posted by eloi2017 at 2018-01-30 20:59:55
第一点是满足的，关于第二点，因为老板说有内源性DpnI活性，可以不额外加，大家也都这么做成的，所以就没有反复尝试。请问一下酶切前后都需要胶回收纯化吗？谢谢您！...

纯化总是好的。
不过你的详细做法我不太明确。。点突变invert PCR整个质粒就好，为什么要酶切？
如果不介意跟我说具体步骤，我可能诊断地更好些
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Progress in science depends on new techniques, new discoveries and new ideas, probably in that order. -- Nobel laureate Sydney Brenner
15楼2018-01-30 22:16:10
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awaken2013

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drwhoknowss: 金币+1, 鼓励交流 2018-01-31 11:48:36
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11楼: Originally posted by eloi2017 at 2018-01-30 21:06:08
DpnI即使有内源性活性也要额外加吗？您一般消化多长时间？

引物：GGCCCTACgatATTCAGATGGCCTCAG

条件：98度 5min
          98度 2min，55度30s，72度4min30，25循环
          72度 5min
没有细抠过条件， ...

特异性不知道  降低循环数少于10  调整退火温度  dpn1 处理2小时 过夜连接

突变我都不知道做了几百个 关键摸准退火温度

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12楼2018-01-30 21:16:54
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eloi2017

新虫 (初入文坛)
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17楼: Originally posted by awaken2013 at 2018-01-30 23:08:45
不需要纯化 徒增加损失
...

好的，谢谢您！我试试去
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19楼2018-01-31 16:20:09
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awaken2013

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点突变可以尝试反向pcr

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5楼2018-01-30 18:56:19
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drwhoknowss

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成功关键有两点。
1PCR时，用极少的WT质粒做模版。<1ng
2. Dpn1处理，
如果你都做得好。那就请提供其他步骤的细节
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8楼2018-01-30 20:09:28
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awaken2013

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7楼: Originally posted by eloi2017 at 2018-01-30 19:22:48
您是指用一对方向相反的引物扩整个质粒么？试过几次，出来都全是WT。。有一次加了dpnI消化，结果什么也没长。。您有什么好建议么？谢谢您！...

dpn1肯定要加 你pcr没做好 引物 条件

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9楼2018-01-30 20:27:51
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eloi2017

新虫 (初入文坛)
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12楼: Originally posted by awaken2013 at 2018-01-30 21:16:54
特异性不知道  降低循环数少于10  调整退火温度  dpn1 处理2小时 过夜连接
突变我都不知道做了几百个 关键摸准退火温度
...

您是指只用10个循环吗？那是不是就不用纯化了，直接PCR体系里加DpnI，处理完80度灭活直接加连接酶？

谢谢您！
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13楼2018-01-30 21:37:39
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712345678

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我觉得12楼的挺好的。可以可以试试。其实我也不喜欢

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14楼2018-01-30 22:10:15
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712345678

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我觉得你切的有问题。嘿嘿。我也不懂

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2楼2018-01-30 17:16:14
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eloi2017

新虫 (初入文坛)
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2楼: Originally posted by 712345678 at 2018-01-30 17:16:14
我觉得你切的有问题。嘿嘿。我也不懂

能有什么问题呢？条带出来是对的啊。。
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3楼2018-01-30 17:32:56
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712345678

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你都切过了，条带里面的顺序肯定不一样啊

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4楼2018-01-30 17:35:27
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eloi2017

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4楼: Originally posted by 712345678 at 2018-01-30 17:35:27
你都切过了，条带里面的顺序肯定不一样啊

啊？切过为啥会影响条带里面的顺序。。。
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6楼2018-01-30 18:59:42
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eloi2017

新虫 (初入文坛)
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5楼: Originally posted by awaken2013 at 2018-01-30 18:56:19
点突变可以尝试反向pcr

您是指用一对方向相反的引物扩整个质粒么？试过几次，出来都全是WT。。有一次加了dpnI消化，结果什么也没长。。您有什么好建议么？谢谢您！
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7楼2018-01-30 19:22:48
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eloi2017

新虫 (初入文坛)
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8楼: Originally posted by drwhoknowss at 2018-01-30 20:09:28
成功关键有两点。
1PCR时，用极少的WT质粒做模版。&lt;1ng
2. Dpn1处理，
如果你都做得好。那就请提供其他步骤的细节

第一点是满足的，关于第二点，因为老板说有内源性DpnI活性，可以不额外加，大家也都这么做成的，所以就没有反复尝试。请问一下酶切前后都需要胶回收纯化吗？谢谢您！
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10楼2018-01-30 20:59:55
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