24小时热门版块排行榜    

CyRhmU.jpeg
查看: 5084  |  回复: 22

eloi2017

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
9楼: Originally posted by awaken2013 at 2018-01-30 20:27:51
dpn1肯定要加 你pcr没做好 引物 条件
...

DpnI即使有内源性活性也要额外加吗?您一般消化多长时间?

引物:GGCCCTACgatATTCAGATGGCCTCAG

条件:98度 5min
          98度 2min,55度30s,72度4min30,25循环
          72度 5min
没有细抠过条件,因为PCR跑完看条带都没什么问题就一直这样了。。您看看行不?

谢谢您!
11楼2018-01-30 21:06:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

awaken2013

铜虫 (小有名气)

★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
drwhoknowss: 金币+1, 鼓励交流 2018-01-31 11:48:36
引用回帖:
11楼: Originally posted by eloi2017 at 2018-01-30 21:06:08
DpnI即使有内源性活性也要额外加吗?您一般消化多长时间?

引物:GGCCCTACgatATTCAGATGGCCTCAG

条件:98度 5min
          98度 2min,55度30s,72度4min30,25循环
          72度 5min
没有细抠过条件, ...

特异性不知道  降低循环数少于10  调整退火温度  dpn1 处理2小时 过夜连接

突变我都不知道做了几百个 关键摸准退火温度

发自小木虫IOS客户端
12楼2018-01-30 21:16:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

eloi2017

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
12楼: Originally posted by awaken2013 at 2018-01-30 21:16:54
特异性不知道  降低循环数少于10  调整退火温度  dpn1 处理2小时 过夜连接
突变我都不知道做了几百个 关键摸准退火温度
...

您是指只用10个循环吗?那是不是就不用纯化了,直接PCR体系里加DpnI,处理完80度灭活直接加连接酶?

谢谢您!
13楼2018-01-30 21:37:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

712345678

新虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
我觉得12楼的挺好的。可以可以试试。其实我也不喜欢

发自小木虫Android客户端
14楼2018-01-30 22:10:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

drwhoknowss

荣誉版主 (正式写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
10楼: Originally posted by eloi2017 at 2018-01-30 20:59:55
第一点是满足的,关于第二点,因为老板说有内源性DpnI活性,可以不额外加,大家也都这么做成的,所以就没有反复尝试。请问一下酶切前后都需要胶回收纯化吗?谢谢您!...

纯化总是好的。
不过你的详细做法我不太明确。。点突变invert PCR整个质粒就好,为什么要酶切?
如果不介意跟我说具体步骤,我可能诊断地更好些
Progress in science depends on new techniques, new discoveries and new ideas, probably in that order. -- Nobel laureate Sydney Brenner
15楼2018-01-30 22:16:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

eloi2017

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
15楼: Originally posted by drwhoknowss at 2018-01-30 22:16:10
纯化总是好的。
不过你的详细做法我不太明确。。点突变invert PCR整个质粒就好,为什么要酶切?
如果不介意跟我说具体步骤,我可能诊断地更好些...

因为出不来结果所以做回传统的酶切连接了。。结果还是不行。。

我具体步骤就是先PCR:正向引物GGCCCTACgatATTCAGATGGCCTCAG,条件98度 5min,(98度 2min,55度30s,72度4min30,25循环),72度 5min,总共大概8k。然后加DpnI 3小时左右,80度灭活,加T4连接酶14度过夜,然后转化,啥也没长。。您看还需要什么具体步骤么?谢谢了!
16楼2018-01-30 22:41:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

awaken2013

铜虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
13楼: Originally posted by eloi2017 at 2018-01-30 21:37:39
您是指只用10个循环吗?那是不是就不用纯化了,直接PCR体系里加DpnI,处理完80度灭活直接加连接酶?

谢谢您!...

不需要纯化 徒增加损失

发自小木虫IOS客户端
17楼2018-01-30 23:08:45
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

drwhoknowss

荣誉版主 (正式写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
16楼: Originally posted by eloi2017 at 2018-01-30 22:41:39
因为出不来结果所以做回传统的酶切连接了。。结果还是不行。。

我具体步骤就是先PCR:正向引物GGCCCTACgatATTCAGATGGCCTCAG,条件98度 5min,(98度 2min,55度30s,72度4min30,25循环),72度 5min,总共大概 ...

好像没问题,高保真polymerase没有overhang。
只能一一排除其他的了
1. 加一个T4连接的对照。
2. 加一个转化对照
我也想不出别的了,希望有帮助吧
看其他虫子有其他想法
Progress in science depends on new techniques, new discoveries and new ideas, probably in that order. -- Nobel laureate Sydney Brenner
18楼2018-01-30 23:33:33
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

eloi2017

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
17楼: Originally posted by awaken2013 at 2018-01-30 23:08:45
不需要纯化 徒增加损失
...

好的,谢谢您!我试试去
19楼2018-01-31 16:20:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

eloi2017

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
18楼: Originally posted by drwhoknowss at 2018-01-30 23:33:33
好像没问题,高保真polymerase没有overhang。
只能一一排除其他的了
1. 加一个T4连接的对照。
2. 加一个转化对照
我也想不出别的了,希望有帮助吧
看其他虫子有其他想法...

没有overhang是不是只对T载体有影响?转化加了阳性对照,长了。。
20楼2018-01-31 16:22:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 eloi2017 的主题更新
普通表情 高级回复(可上传附件)
信息提示
请填处理意见