应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 点突变半年了还没出来。。求助。。
232/3返回列表上一页123下一页
查看: 5348  |  回复: 22
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

eloi2017

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by awaken2013 at 2018-01-30 20:27:51
dpn1肯定要加 你pcr没做好 引物 条件
...

DpnI即使有内源性活性也要额外加吗？您一般消化多长时间？

引物：GGCCCTACgatATTCAGATGGCCTCAG

条件：98度 5min
          98度 2min，55度30s，72度4min30，25循环
          72度 5min
没有细抠过条件，因为PCR跑完看条带都没什么问题就一直这样了。。您看看行不？

谢谢您！
赞一下 回复此楼
11楼2018-01-30 21:06:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

awaken2013

铜虫 (小有名气)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
drwhoknowss: 金币+1, 鼓励交流 2018-01-31 11:48:36
引用回帖:
11楼: Originally posted by eloi2017 at 2018-01-30 21:06:08
DpnI即使有内源性活性也要额外加吗？您一般消化多长时间？

引物：GGCCCTACgatATTCAGATGGCCTCAG

条件：98度 5min
          98度 2min，55度30s，72度4min30，25循环
          72度 5min
没有细抠过条件， ...

特异性不知道  降低循环数少于10  调整退火温度  dpn1 处理2小时 过夜连接

突变我都不知道做了几百个 关键摸准退火温度

发自小木虫IOS客户端
赞一下(2人) 回复此楼
12楼2018-01-30 21:16:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

eloi2017

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
12楼: Originally posted by awaken2013 at 2018-01-30 21:16:54
特异性不知道  降低循环数少于10  调整退火温度  dpn1 处理2小时 过夜连接
突变我都不知道做了几百个 关键摸准退火温度
...

您是指只用10个循环吗？那是不是就不用纯化了，直接PCR体系里加DpnI，处理完80度灭活直接加连接酶？

谢谢您！
赞一下(1人) 回复此楼
13楼2018-01-30 21:37:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

712345678

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我觉得12楼的挺好的。可以可以试试。其实我也不喜欢

发自小木虫Android客户端
赞一下(1人) 回复此楼
14楼2018-01-30 22:10:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

drwhoknowss

荣誉版主 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
10楼: Originally posted by eloi2017 at 2018-01-30 20:59:55
第一点是满足的，关于第二点，因为老板说有内源性DpnI活性，可以不额外加，大家也都这么做成的，所以就没有反复尝试。请问一下酶切前后都需要胶回收纯化吗？谢谢您！...

纯化总是好的。
不过你的详细做法我不太明确。。点突变invert PCR整个质粒就好，为什么要酶切？
如果不介意跟我说具体步骤，我可能诊断地更好些
赞一下(3人) 回复此楼
Progress in science depends on new techniques, new discoveries and new ideas, probably in that order. -- Nobel laureate Sydney Brenner
15楼2018-01-30 22:16:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

eloi2017

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
15楼: Originally posted by drwhoknowss at 2018-01-30 22:16:10
纯化总是好的。
不过你的详细做法我不太明确。。点突变invert PCR整个质粒就好，为什么要酶切？
如果不介意跟我说具体步骤，我可能诊断地更好些...

因为出不来结果所以做回传统的酶切连接了。。结果还是不行。。

我具体步骤就是先PCR：正向引物GGCCCTACgatATTCAGATGGCCTCAG，条件98度 5min，（98度 2min，55度30s，72度4min30，25循环），72度 5min，总共大概8k。然后加DpnI 3小时左右，80度灭活，加T4连接酶14度过夜，然后转化，啥也没长。。您看还需要什么具体步骤么？谢谢了！
赞一下 回复此楼
16楼2018-01-30 22:41:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

awaken2013

铜虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
13楼: Originally posted by eloi2017 at 2018-01-30 21:37:39
您是指只用10个循环吗？那是不是就不用纯化了，直接PCR体系里加DpnI，处理完80度灭活直接加连接酶？

谢谢您！...

不需要纯化 徒增加损失

发自小木虫IOS客户端
赞一下 回复此楼
17楼2018-01-30 23:08:45
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

drwhoknowss

荣誉版主 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
16楼: Originally posted by eloi2017 at 2018-01-30 22:41:39
因为出不来结果所以做回传统的酶切连接了。。结果还是不行。。

我具体步骤就是先PCR：正向引物GGCCCTACgatATTCAGATGGCCTCAG，条件98度 5min，（98度 2min，55度30s，72度4min30，25循环），72度 5min，总共大概 ...

好像没问题，高保真polymerase没有overhang。
只能一一排除其他的了
1. 加一个T4连接的对照。
2. 加一个转化对照
我也想不出别的了，希望有帮助吧
看其他虫子有其他想法
赞一下 回复此楼
Progress in science depends on new techniques, new discoveries and new ideas, probably in that order. -- Nobel laureate Sydney Brenner
18楼2018-01-30 23:33:33
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

eloi2017

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
17楼: Originally posted by awaken2013 at 2018-01-30 23:08:45
不需要纯化 徒增加损失
...

好的，谢谢您！我试试去
赞一下(2人) 回复此楼
19楼2018-01-31 16:20:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

eloi2017

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
18楼: Originally posted by drwhoknowss at 2018-01-30 23:33:33
好像没问题，高保真polymerase没有overhang。
只能一一排除其他的了
1. 加一个T4连接的对照。
2. 加一个转化对照
我也想不出别的了，希望有帮助吧
看其他虫子有其他想法...

没有overhang是不是只对T载体有影响？转化加了阳性对照，长了。。
赞一下 回复此楼
20楼2018-01-31 16:22:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 eloi2017 的主题更新
232/3返回列表上一页123下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[公派出国] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +3 cBGhfJFuNMca 2026-08-02 8/400 2026-08-02 15:01 by jHcrHMhbKCFV
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +3 cBGhfJFuNMca 2026-08-02 14/700 2026-08-02 14:58 by jHcrHMhbKCFV
[博后之家] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 cBGhfJFuNMca 2026-08-02 18/900 2026-08-02 14:52 by jHcrHMhbKCFV
[基金申请] 面上提前没消息，有中的吗 +7 archvillain 2026-08-02 9/450 2026-08-02 14:36 by biomichael
[找工作] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 cBGhfJFuNMca 2026-08-02 12/600 2026-08-02 13:43 by jHcrHMhbKCFV
[基金申请] 面上再次挂了，太难了，躺也躺不了，倦也卷不过，小学校之殇！ +17 低垂的野花 2026-07-31 23/1150 2026-08-02 13:41 by RRRKKK
[找工作] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 cBGhfJFuNMca 2026-08-02 16/800 2026-08-02 13:34 by jHcrHMhbKCFV
[博后之家] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +3 cBGhfJFuNMca 2026-08-02 14/700 2026-08-02 13:34 by jHcrHMhbKCFV
[基金申请] 2026年国自然面上资助率 +15 布布和一二 2026-07-30 21/1050 2026-08-02 10:56 by iaeyuan
[教师之家] 基础研究怎么拉横向，学校到款任务越来越多，难以完成 拉横向，都有哪些途径啊 +8 锦衣卫寒战 2026-07-28 10/500 2026-08-02 10:00 by 锦衣卫寒战
[考博] 2027年申博 50+3 射雕英雄胜 2026-07-30 3/150 2026-08-02 09:36 by lfy8008
[有机交流] 一个有机合成实验室都需要哪些设备？ 50+3 kf2781974 2026-07-31 7/350 2026-08-02 07:59 by 88817753
[基金申请] 微信指数没变化，科研之友没阅读 +14 wangze12014 2026-07-28 18/900 2026-07-31 18:35 by lzchaihuo
[高分子] HXDI做水性聚氨酯乳液，是不是特别容易出渣 15+3 yuyusuv 2026-07-29 3/150 2026-07-31 09:21 by huizingga
[基金申请] 系统今天又提示维护了，估计离放榜不远了 +11 winnerche 2026-07-29 15/750 2026-07-30 23:08 by jnhyjjm
[基金申请] 你们的时间戳变了吗 +3 archvillain 2026-07-30 4/200 2026-07-30 18:53 by levinzhwen
[有机交流] 产物和副产物价值比较 30+4 小汤02 2026-07-27 5/250 2026-07-30 12:44 by czyzsu
[基金申请] 这种情况还有戏吗 +5 drbart 2026-07-27 11/550 2026-07-29 05:50 by drbart
[基金申请] 同事接到电话了，我却没有 +4 1234567wang 2026-07-27 4/200 2026-07-28 10:11 by GOODLUCKER
[基金申请] 准备明年的基金了 +5 Tide man 2026-07-27 5/250 2026-07-28 09:25 by newfuzzy1
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭