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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 点突变半年了还没出来。。求助。。
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eloi2017

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by awaken2013 at 2018-01-30 20:27:51
dpn1肯定要加 你pcr没做好 引物 条件
...

DpnI即使有内源性活性也要额外加吗？您一般消化多长时间？

引物：GGCCCTACgatATTCAGATGGCCTCAG

条件：98度 5min
          98度 2min，55度30s，72度4min30，25循环
          72度 5min
没有细抠过条件，因为PCR跑完看条带都没什么问题就一直这样了。。您看看行不？

谢谢您！
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11楼2018-01-30 21:06:08
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awaken2013

铜虫 (小有名气)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
drwhoknowss: 金币+1, 鼓励交流 2018-01-31 11:48:36
引用回帖:
11楼: Originally posted by eloi2017 at 2018-01-30 21:06:08
DpnI即使有内源性活性也要额外加吗？您一般消化多长时间？

引物：GGCCCTACgatATTCAGATGGCCTCAG

条件：98度 5min
          98度 2min，55度30s，72度4min30，25循环
          72度 5min
没有细抠过条件， ...

特异性不知道  降低循环数少于10  调整退火温度  dpn1 处理2小时 过夜连接

突变我都不知道做了几百个 关键摸准退火温度

发自小木虫IOS客户端
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12楼2018-01-30 21:16:54
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eloi2017

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
12楼: Originally posted by awaken2013 at 2018-01-30 21:16:54
特异性不知道  降低循环数少于10  调整退火温度  dpn1 处理2小时 过夜连接
突变我都不知道做了几百个 关键摸准退火温度
...

您是指只用10个循环吗？那是不是就不用纯化了，直接PCR体系里加DpnI，处理完80度灭活直接加连接酶？

谢谢您！
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13楼2018-01-30 21:37:39
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712345678

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我觉得12楼的挺好的。可以可以试试。其实我也不喜欢

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14楼2018-01-30 22:10:15
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drwhoknowss

荣誉版主 (正式写手)
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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10楼: Originally posted by eloi2017 at 2018-01-30 20:59:55
第一点是满足的，关于第二点，因为老板说有内源性DpnI活性，可以不额外加，大家也都这么做成的，所以就没有反复尝试。请问一下酶切前后都需要胶回收纯化吗？谢谢您！...

纯化总是好的。
不过你的详细做法我不太明确。。点突变invert PCR整个质粒就好，为什么要酶切？
如果不介意跟我说具体步骤，我可能诊断地更好些
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Progress in science depends on new techniques, new discoveries and new ideas, probably in that order. -- Nobel laureate Sydney Brenner
15楼2018-01-30 22:16:10
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eloi2017

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
15楼: Originally posted by drwhoknowss at 2018-01-30 22:16:10
纯化总是好的。
不过你的详细做法我不太明确。。点突变invert PCR整个质粒就好，为什么要酶切？
如果不介意跟我说具体步骤，我可能诊断地更好些...

因为出不来结果所以做回传统的酶切连接了。。结果还是不行。。

我具体步骤就是先PCR：正向引物GGCCCTACgatATTCAGATGGCCTCAG，条件98度 5min，（98度 2min，55度30s，72度4min30，25循环），72度 5min，总共大概8k。然后加DpnI 3小时左右，80度灭活，加T4连接酶14度过夜，然后转化，啥也没长。。您看还需要什么具体步骤么？谢谢了！
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16楼2018-01-30 22:41:39
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awaken2013

铜虫 (小有名气)
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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13楼: Originally posted by eloi2017 at 2018-01-30 21:37:39
您是指只用10个循环吗？那是不是就不用纯化了，直接PCR体系里加DpnI，处理完80度灭活直接加连接酶？

谢谢您！...

不需要纯化 徒增加损失

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17楼2018-01-30 23:08:45
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drwhoknowss

荣誉版主 (正式写手)
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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16楼: Originally posted by eloi2017 at 2018-01-30 22:41:39
因为出不来结果所以做回传统的酶切连接了。。结果还是不行。。

我具体步骤就是先PCR：正向引物GGCCCTACgatATTCAGATGGCCTCAG，条件98度 5min，（98度 2min，55度30s，72度4min30，25循环），72度 5min，总共大概 ...

好像没问题，高保真polymerase没有overhang。
只能一一排除其他的了
1. 加一个T4连接的对照。
2. 加一个转化对照
我也想不出别的了，希望有帮助吧
看其他虫子有其他想法
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Progress in science depends on new techniques, new discoveries and new ideas, probably in that order. -- Nobel laureate Sydney Brenner
18楼2018-01-30 23:33:33
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eloi2017

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
17楼: Originally posted by awaken2013 at 2018-01-30 23:08:45
不需要纯化 徒增加损失
...

好的，谢谢您！我试试去
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19楼2018-01-31 16:20:09
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eloi2017

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
18楼: Originally posted by drwhoknowss at 2018-01-30 23:33:33
好像没问题，高保真polymerase没有overhang。
只能一一排除其他的了
1. 加一个T4连接的对照。
2. 加一个转化对照
我也想不出别的了，希望有帮助吧
看其他虫子有其他想法...

没有overhang是不是只对T载体有影响？转化加了阳性对照，长了。。
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20楼2018-01-31 16:22:21
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