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eloi2017

新虫 (初入文坛)

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[交流] 点突变半年了还没出来。。求助。。已有4人参与

要突变启动子上一个位点，试了酶切连接，NEB的HiFi Assembly，定点突变，用过TOP10F'和NEB 10ß做转化，每次不是不长就是WT。。

比如这次，俩片断PCR完了跑胶看没问题，俩片断和质粒酶切完胶回收也都ok，然后连接完长出来还是WT。。想不明白这WT是哪儿来的，按说体系里应该没有了啊。。

求各位大神指点迷津。。

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1楼2018-01-30 16:50:50

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drwhoknowss

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引用回帖:

16楼: Originally posted by eloi2017 at 2018-01-30 22:41:39
因为出不来结果所以做回传统的酶切连接了。。结果还是不行。。

我具体步骤就是先PCR：正向引物GGCCCTACgatATTCAGATGGCCTCAG，条件98度 5min，（98度 2min，55度30s，72度4min30，25循环），72度 5min，总共大概 ...

好像没问题，高保真polymerase没有overhang。
只能一一排除其他的了
1. 加一个T4连接的对照。
2. 加一个转化对照
我也想不出别的了，希望有帮助吧
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