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eloi2017

新虫 (初入文坛)

[交流] 点突变半年了还没出来。。求助。。已有4人参与

要突变启动子上一个位点,试了酶切连接,NEB的HiFi Assembly,定点突变,用过TOP10F'和NEB 10ß做转化,每次不是不长就是WT。。

比如这次,俩片断PCR完了跑胶看没问题,俩片断和质粒酶切完胶回收也都ok,然后连接完长出来还是WT。。想不明白这WT是哪儿来的,按说体系里应该没有了啊。。

求各位大神指点迷津。。
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eloi2017

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
15楼: Originally posted by drwhoknowss at 2018-01-30 22:16:10
纯化总是好的。
不过你的详细做法我不太明确。。点突变invert PCR整个质粒就好,为什么要酶切?
如果不介意跟我说具体步骤,我可能诊断地更好些...

因为出不来结果所以做回传统的酶切连接了。。结果还是不行。。

我具体步骤就是先PCR:正向引物GGCCCTACgatATTCAGATGGCCTCAG,条件98度 5min,(98度 2min,55度30s,72度4min30,25循环),72度 5min,总共大概8k。然后加DpnI 3小时左右,80度灭活,加T4连接酶14度过夜,然后转化,啥也没长。。您看还需要什么具体步骤么?谢谢了!
16楼2018-01-30 22:41:39
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712345678

新虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
我觉得你切的有问题。嘿嘿。我也不懂

发自小木虫Android客户端
2楼2018-01-30 17:16:14
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eloi2017

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 712345678 at 2018-01-30 17:16:14
我觉得你切的有问题。嘿嘿。我也不懂

能有什么问题呢?条带出来是对的啊。。
3楼2018-01-30 17:32:56
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712345678

新虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
你都切过了,条带里面的顺序肯定不一样啊

发自小木虫Android客户端
4楼2018-01-30 17:35:27
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