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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 点突变半年了还没出来。。求助。。
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eloi2017

新虫 (初入文坛)

[交流] 点突变半年了还没出来。。求助。。已有4人参与

要突变启动子上一个位点，试了酶切连接，NEB的HiFi Assembly，定点突变，用过TOP10F'和NEB 10ß做转化，每次不是不长就是WT。。

比如这次，俩片断PCR完了跑胶看没问题，俩片断和质粒酶切完胶回收也都ok，然后连接完长出来还是WT。。想不明白这WT是哪儿来的，按说体系里应该没有了啊。。

求各位大神指点迷津。。
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1楼2018-01-30 16:50:50
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drwhoknowss

荣誉版主 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
10楼: Originally posted by eloi2017 at 2018-01-30 20:59:55
第一点是满足的，关于第二点，因为老板说有内源性DpnI活性，可以不额外加，大家也都这么做成的，所以就没有反复尝试。请问一下酶切前后都需要胶回收纯化吗？谢谢您！...

纯化总是好的。
不过你的详细做法我不太明确。。点突变invert PCR整个质粒就好，为什么要酶切？
如果不介意跟我说具体步骤，我可能诊断地更好些
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Progress in science depends on new techniques, new discoveries and new ideas, probably in that order. -- Nobel laureate Sydney Brenner
15楼2018-01-30 22:16:10
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712345678

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我觉得你切的有问题。嘿嘿。我也不懂

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2楼2018-01-30 17:16:14
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eloi2017

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 712345678 at 2018-01-30 17:16:14
我觉得你切的有问题。嘿嘿。我也不懂

能有什么问题呢？条带出来是对的啊。。
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3楼2018-01-30 17:32:56
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712345678

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你都切过了，条带里面的顺序肯定不一样啊

发自小木虫Android客户端
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4楼2018-01-30 17:35:27
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