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eloi2017

新虫 (初入文坛)

[交流] 点突变半年了还没出来。。求助。。已有4人参与

要突变启动子上一个位点,试了酶切连接,NEB的HiFi Assembly,定点突变,用过TOP10F'和NEB 10ß做转化,每次不是不长就是WT。。

比如这次,俩片断PCR完了跑胶看没问题,俩片断和质粒酶切完胶回收也都ok,然后连接完长出来还是WT。。想不明白这WT是哪儿来的,按说体系里应该没有了啊。。

求各位大神指点迷津。。
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eloi2017

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
8楼: Originally posted by drwhoknowss at 2018-01-30 20:09:28
成功关键有两点。
1PCR时,用极少的WT质粒做模版。<1ng
2. Dpn1处理,
如果你都做得好。那就请提供其他步骤的细节

第一点是满足的,关于第二点,因为老板说有内源性DpnI活性,可以不额外加,大家也都这么做成的,所以就没有反复尝试。请问一下酶切前后都需要胶回收纯化吗?谢谢您!
10楼2018-01-30 20:59:55
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712345678

新虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
我觉得你切的有问题。嘿嘿。我也不懂

发自小木虫Android客户端
2楼2018-01-30 17:16:14
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eloi2017

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 712345678 at 2018-01-30 17:16:14
我觉得你切的有问题。嘿嘿。我也不懂

能有什么问题呢?条带出来是对的啊。。
3楼2018-01-30 17:32:56
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712345678

新虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
你都切过了,条带里面的顺序肯定不一样啊

发自小木虫Android客户端
4楼2018-01-30 17:35:27
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