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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 质粒和片段的融合PCR
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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maoxuequn

新虫 (小有名气)

[求助] 质粒和片段的融合PCR

对片段和载体一起设置引物，用的是pet的22，分别进行pcr回收，跑胶。然后用试剂盒进行重组。
但是就是连不上。每次涂平板长出来的菌都是空载。技术反应说是载体在回收的时候把模板也回收进去，这就会长出很多空载。
我是新手，不明白为什么，根据说明书上帝要求，tm值要有60。载体和片段都是按照比例来的。但是为什么就是连不上？
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1楼 2017-09-18 22:05:45
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白话八股

金虫 (正式写手)
质粒和片段做融合pcr？你干嘛不直接用无缝克隆做。

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maoxuequn
最爱的那个人会出现在身边。
2楼2017-09-19 01:30:11
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maoxuequn

新虫 (小有名气)
送红花一朵
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2楼: Originally posted by 白话八股 at 2017-09-19 01:30:11
质粒和片段做融合pcr？你干嘛不直接用无缝克隆做。

这个试剂盒也是说很快的，只要把片段和载体线性化后以比例加在一起反应15min就可以做转化了

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3楼2017-09-19 06:48:47
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白话八股

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by maoxuequn at 2017-09-19 06:48:47
这个试剂盒也是说很快的，只要把片段和载体线性化后以比例加在一起反应15min就可以做转化了
...

来个试用装，分分钟搞定，阳性率还高
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最爱的那个人会出现在身边。
4楼2017-09-19 10:55:40
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maoxuequn

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 白话八股 at 2017-09-19 01:30:11
质粒和片段做融合pcr？你干嘛不直接用无缝克隆做。

我做的就是无缝克隆。感受态没问题，tm没问题（58和60）。试剂盒本身的模板和载体做了对照 没问题。线性化载体做了感受态，没问题。是不是最大的问题就是目的基因。但是想不出原因？是纯化还是引物设计。

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5楼2017-09-19 11:56:50
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wareer

铜虫 (小有名气)
无缝克隆应该不会空载，除非你直接把载体不留空线性化了

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6楼2017-10-31 22:02:52
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liuxiaofei

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by maoxuequn at 2017-09-19 11:56:50
我做的就是无缝克隆。感受态没问题，tm没问题（58和60）。试剂盒本身的模板和载体做了对照 没问题。线性化载体做了感受态，没问题。是不是最大的问题就是目的基因。但是想不出原因？是纯化还是引物设计。
...

这种事情没办法解释，我同事构了七个载体用这种方法，结果四个始终构不成，载体重新切、片段重新扩，就是不行，这个时候就还用传统的酶切位点了

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7楼2017-11-18 16:35:29
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liuxiaofei

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by liuxiaofei at 2017-11-18 16:35:29
这种事情没办法解释，我同事构了七个载体用这种方法，结果四个始终构不成，载体重新切、片段重新扩，就是不行，这个时候就还用传统的酶切位点了
...

同时

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8楼2017-11-18 16:36:45
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