应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 质粒和片段的融合PCR
81/1返回列表
查看: 1936  |  回复: 7
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

maoxuequn

新虫 (小有名气)

[求助] 质粒和片段的融合PCR

对片段和载体一起设置引物，用的是pet的22，分别进行pcr回收，跑胶。然后用试剂盒进行重组。
但是就是连不上。每次涂平板长出来的菌都是空载。技术反应说是载体在回收的时候把模板也回收进去，这就会长出很多空载。
我是新手，不明白为什么，根据说明书上帝要求，tm值要有60。载体和片段都是按照比例来的。但是为什么就是连不上？
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2017-09-18 22:05:45
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

白话八股

金虫 (正式写手)
质粒和片段做融合pcr？你干嘛不直接用无缝克隆做。

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼

» 本帖已获得的红花（最新10朵）

maoxuequn
最爱的那个人会出现在身边。
2楼2017-09-19 01:30:11
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

maoxuequn

新虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by 白话八股 at 2017-09-19 01:30:11
质粒和片段做融合pcr？你干嘛不直接用无缝克隆做。

这个试剂盒也是说很快的，只要把片段和载体线性化后以比例加在一起反应15min就可以做转化了

发自小木虫IOS客户端
赞一下 回复此楼
3楼2017-09-19 06:48:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

白话八股

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by maoxuequn at 2017-09-19 06:48:47
这个试剂盒也是说很快的，只要把片段和载体线性化后以比例加在一起反应15min就可以做转化了
...

来个试用装，分分钟搞定，阳性率还高
赞一下 回复此楼
最爱的那个人会出现在身边。
4楼2017-09-19 10:55:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

maoxuequn

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 白话八股 at 2017-09-19 01:30:11
质粒和片段做融合pcr？你干嘛不直接用无缝克隆做。

我做的就是无缝克隆。感受态没问题，tm没问题（58和60）。试剂盒本身的模板和载体做了对照 没问题。线性化载体做了感受态，没问题。是不是最大的问题就是目的基因。但是想不出原因？是纯化还是引物设计。

发自小木虫IOS客户端
赞一下 回复此楼
5楼2017-09-19 11:56:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wareer

铜虫 (小有名气)
无缝克隆应该不会空载，除非你直接把载体不留空线性化了

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
6楼2017-10-31 22:02:52
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

liuxiaofei

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by maoxuequn at 2017-09-19 11:56:50
我做的就是无缝克隆。感受态没问题，tm没问题（58和60）。试剂盒本身的模板和载体做了对照 没问题。线性化载体做了感受态，没问题。是不是最大的问题就是目的基因。但是想不出原因？是纯化还是引物设计。
...

这种事情没办法解释，我同事构了七个载体用这种方法，结果四个始终构不成，载体重新切、片段重新扩，就是不行，这个时候就还用传统的酶切位点了

发自小木虫IOS客户端
赞一下 回复此楼
7楼2017-11-18 16:35:29
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

liuxiaofei

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by liuxiaofei at 2017-11-18 16:35:29
这种事情没办法解释，我同事构了七个载体用这种方法，结果四个始终构不成，载体重新切、片段重新扩，就是不行，这个时候就还用传统的酶切位点了
...

同时

发自小木虫IOS客户端
回复此楼
8楼2017-11-18 16:36:45
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 maoxuequn 的主题更新
81/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭