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目的基因连接载体 已有1人参与
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各位大神看看我这个目的基因和载体连接上了没有啊 么么么哒 （琼脂糖凝胶电泳） 目的基因 759bp 载体 4000bp marker200-4500 图从左往右依次是 marker 目的基因 载体 重组的质粒 发自小木虫IOS客户端 |
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2楼2017-08-10 14:35:00
llsskk112233
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3楼2017-08-10 14:51:39
4楼2017-08-10 15:38:57
晋鹏
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【答案】应助回帖
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1、酶有没有坏 内切酶可以找载体分别做单酶切后电泳验证 连接酶可以用单酶切的载体，割胶纯化后，让其自连。注意要作一个不加连接酶的对照。 连接酶的buffer要小心，它比较容易坏，建议买来后先10－20ul分装，用一次取一管，多余的部分都扔了，不要反复冻融。 2、感受态细胞 用已知浓度的质粒，稀释后，做转化，涂板，看菌落数来判断感受态的效率。这一步，同时把平板的问题也解决了。 3、连接比例 多做几个比例尝试，记住一点，不要怕载体不够，载体过多会严重影响连接效率的。我的经验是，取5ug载体，双酶切后，割胶纯化，溶于100ul水中，再稀释5－10倍后，取1ul用于10－20ul的连接体系。至于插入片段，根据电泳结果，如果比较浓的，就加1ul，很淡的话就加7ul，这个影响不是很大的。 4、酶切位点的问题 这个问题比较少见，主要出现在载体上的两个酶切位点是连在一起的时候，可能出现一个位点切开后，导致另一个位点的保护碱基不足而无法切开，这样的话，你要考虑不要两个酶分开切，先切难切的，再切容易切的。 在选择双酶切载体的时候，尽量选择带插入片段的质粒，这样载体的双酶切是否成功比较明确。 |
5楼2017-08-10 16:39:47
第二泳道应该是载体单酶切电泳图，一般验证目的片段和载体是否连接上的方法：单酶切和载体单酶切跑胶比对，连接产物4759bp，载体4kb，酶切验证无误，还需要送到公司测序，测序结果还需要进行NCBI-blast序列比对，直到100%了，才算链接成功。还望对你有帮助 发自小木虫IOS客户端 |
6楼2017-08-11 16:50:35
7楼2017-08-11 16:51:51