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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 目的基因连接载体
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美美肉

新虫 (初入文坛)

[求助] 目的基因连接载体 已有1人参与

各位大神看看我这个目的基因和载体连接上了没有啊 么么么哒 （琼脂糖凝胶电泳）
目的基因 759bp 载体 4000bp marker200-4500 图从左往右依次是 marker 目的基因 载体 重组的质粒

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1楼 2017-08-10 14:31:53
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llsskk112233

新虫 (正式写手)
请问你质粒切了多少，还有你应该也需要做转化吧，那你可以再做一个转化后的pcr来进一步验证

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3楼2017-08-10 14:51:39
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美美肉

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
1楼: Originally posted by 美美肉 at 2017-08-10 14:31:53
各位大神看看我这个目的基因和载体连接上了没有啊 么么么哒 （琼脂糖凝胶电泳）
目的基因 759bp 载体 4000bp marker200-4500 图从左往右依次是 marker 目的基因 载体 重组的质粒
...

图为这个
目的基因连接载体



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2楼2017-08-10 14:35:00
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美美肉

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by llsskk112233 at 2017-08-10 14:51:39
请问你质粒切了多少，还有你应该也需要做转化吧，那你可以再做一个转化后的pcr来进一步验证

第三道是转化完挑菌摇菌提质粒后的结果

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4楼2017-08-10 15:38:57
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晋鹏

版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
1、酶有没有坏
内切酶可以找载体分别做单酶切后电泳验证
连接酶可以用单酶切的载体，割胶纯化后，让其自连。注意要作一个不加连接酶的对照。
连接酶的buffer要小心，它比较容易坏，建议买来后先10－20ul分装，用一次取一管，多余的部分都扔了，不要反复冻融。
2、感受态细胞
用已知浓度的质粒，稀释后，做转化，涂板，看菌落数来判断感受态的效率。这一步，同时把平板的问题也解决了。
3、连接比例
多做几个比例尝试，记住一点，不要怕载体不够，载体过多会严重影响连接效率的。我的经验是，取5ug载体，双酶切后，割胶纯化，溶于100ul水中，再稀释5－10倍后，取1ul用于10－20ul的连接体系。至于插入片段，根据电泳结果，如果比较浓的，就加1ul，很淡的话就加7ul，这个影响不是很大的。
4、酶切位点的问题
这个问题比较少见，主要出现在载体上的两个酶切位点是连在一起的时候，可能出现一个位点切开后，导致另一个位点的保护碱基不足而无法切开，这样的话，你要考虑不要两个酶分开切，先切难切的，再切容易切的。
在选择双酶切载体的时候，尽量选择带插入片段的质粒，这样载体的双酶切是否成功比较明确。
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及时行乐，人生不留遗憾！
5楼2017-08-10 16:39:47
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