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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物化学 » 细胞提蛋白问题求助
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时光Coffee

新虫 (初入文坛)

[求助] 细胞提蛋白问题求助 已有3人参与

1.楼主用RIPA提取细胞总蛋白时离心后出现大量透明鼻涕状物，请问哪位高手知道这是怎么回事儿？

具体提蛋白操作步骤如下：
25cm2培养瓶细胞长满后用0.5ml胰酶消化---弃胰酶---2ml培养液吹打---取1ml吹打后细胞悬液于1.5ml离心管---离心去培养液---于沉淀后的细胞中加细胞裂解液202ul（RIPA：PMSF=100：1）---吸头反复吸取至沉淀细胞充分混匀于裂解液中---冰上裂解30~40分钟（楼主有时不想立即处理会将其置于冰箱-7°C过夜，第二天进实验室后方才处理）---离心机4°C，12000rpm，10min离心---吸头弃去鼻涕状白色沉淀（但很多次这个本该是破碎细胞器的白色沉淀物量很多，且为透明鼻涕状）

如上所述，那些透明鼻涕状物是什么？楼主用的是高效RIPA，有可能是因为高效RIPA裂解细胞能力过强将细胞核裂解后DNA溢出而形成的透明鼻涕状物吗？这些透明鼻涕状物如果丢弃会不会影响细胞总蛋白的含量？该如何避免这个问题？是不是不能用高效RIPA提取而要换用普通RIPA呢？如果不是高效RIPA的原因，是否跟楼主将细胞置于冰上裂解过夜，时间过长而没有及时处理放于-20°C，以至于蛋白变性有关呢？

2.提蛋白时除上述出现的现象外，还出现过离心后上清液最上层有白色絮状物存在，这些白色絮状物是什么？如果不去除这些白色絮状物，WB跑胶时会有影响吗？该如何避免这些白色絮状物的存在？是不是细胞太多，裂解液量加的太少以至于没有将细胞充分裂解或者是蛋白没有充分溶解于裂解液中呢？
上述就是楼主现阶段提蛋白出现过的问题，烦请高手赐教，不胜感激！
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1楼 2017-04-18 14:24:01
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小毛虫丽丽

新虫 (初入文坛)
楼主，我第一次做蛋白，想提取细胞核蛋白，但是裂解液不知道该怎么配置，才能提取细胞核蛋白，RIPI裂解液根据百度百科的比例配制可以么？
真心求教。
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2楼2017-06-02 10:32:04
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momo1943

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

高效RIPA<---注意一下SDS%多高, SDS遇低溫會結晶.
我們常使用RIPA<-----SDS最高0.1%.
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3楼2017-06-02 10:51:48
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stabilized

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-06-02 22:41:54
透明装物品是基因组DNA复合物，就是DNA和蛋白或者其它的复合物，如果不需要可以舍弃。如果需要就超声破碎、离心提上清。
http://d.dxy.cn/preview/4859890你可以仔细看看说明书，本人不做蛋白，白色絮状物不太清楚是什么。
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坚持！
4楼2017-06-02 11:14:29
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liuxinyueer

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-06-02 22:42:11
粘稠物质为lysis buffer中detergent浓度不对所致，白色絮状物是脂质。
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欢迎讨论，小木虫未能及时回复，请邮箱: lmzhang1994@gmail.com
5楼2017-06-02 22:37:54
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cathy916

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by liuxinyueer at 2017-06-02 22:37:54
粘稠物质为lysis buffer中detergent浓度不对所致，白色絮状物是脂质。

请问我提蛋白的时候离心之后感觉白色的沉不下去是什么原因呢  以前离心之后总是到底部现在总感觉离的不紧 有白色的絮状物 很容易离心后吸起来  增加离心时间也不行

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6楼2017-06-07 08:21:29
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王大可可可可

新虫 (小有名气)
我也是裂解后高速离心，会有透明粘稠的物质，后来我用细胞超声粉碎仪超声1分钟后在离心就没有了。楼主可以参考下

发自小木虫IOS客户端
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7楼2017-06-15 10:18:18
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