| 查看: 3018 | 回复: 8 | ||||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | ||||
小毛孩24专家顾问 (职业作家)
|
[求助]
荧光定量PCR引物设计-新手求助 已有2人参与
|
|||
|
请问如何设计荧光定量PCR的引物？有什么注意事项？ 是不是在NCBI上找到目的基因的序列，然后粘贴到引物设计的软件里，然后就可以生成了？大致流程是这样吧？ 是不是一般定量PCR的引物扩增的片段就100bp左右？ 如果目的基因比较大，是不是只要找其中一个外显子的序列拿去设计就可以了？比方说，我想检测小鼠TLR4的表达水平，NCBI里讲它有25kbp（不知道有没有理解对？），没有直接显示核酸序列，我看map里面它是由几个片段组成的，就拿其中的NM_021297去设计引物，得到一对扩增100bp序列的引物，这样做对吗？ 从来没有做过qPCR，问题比较多，希望大家不吝赐教，谢谢！ |
回复此楼» 猜你喜欢
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有65人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
-
纳米粒度分析
已经有3人回复
-
林科院林化所招收材料与化工专业硕士，坐标南京
已经有0人回复
-
留学--博士招生
已经有15人回复
-
化学工程，本211，求调剂，ab区不限
已经有4人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 荧光定量PCR试验中，自设探针和引物使得阴性对照跑出曲线，求分析原因？
已经有0人回复
- 这样的引物能做荧光定量PCR吗？
已经有9人回复
- 【分享】荧光定量PCR实验指南（二）
已经有12人回复
- 【分享】realtime pcr 个人经验分享
已经有41人回复
过烟云烟
铁杆木虫 (著名写手)
- 应助: 57 (初中生)
- 金币: 8041.7
- 红花: 21
- 帖子: 1616
- 在线: 354.4小时
- 虫号: 1406756
- 注册: 2011-09-18
- 专业: 躯体感觉、疼痛与镇痛
9楼2016-11-15 01:14:42
过烟云烟
铁杆木虫 (著名写手)
- 应助: 57 (初中生)
- 金币: 8041.7
- 红花: 21
- 帖子: 1616
- 在线: 354.4小时
- 虫号: 1406756
- 注册: 2011-09-18
- 专业: 躯体感觉、疼痛与镇痛
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-10-12 09:14:31
小毛孩24: 金币+10, ★有帮助 2016-10-12 09:36:52
感谢参与，应助指数 +1
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-10-12 09:14:31
小毛孩24: 金币+10, ★有帮助 2016-10-12 09:36:52
|
引物的具体设计要求： 1.引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。最好位于编码区5’端的300-400bp区域内，可以用DNAman,Alignment 软件 看看结果。 2. 产物不能形成二级结构（自由能小于58.61KJ/mol）。 3.引物长度一般在17-25碱基之间,上下游引物不能相差太大。 4.G+C含量在40%~60%之间，45-55％最佳。 5.碱基要随机分布，尽量均匀。 6.引物自身不能有连续4个碱基的互补。 7.引物之间不能有连续4个碱基的互补。 8.引物5′端可以修饰。 9.3′端不可修饰，而且要避开AT,GC rich的区域，避开T/C,A/G连续结构（2-3个）。 10. 引物3′端要避开密码子的第3位。 11.引物整体设计自由能分布5‘端大于3’端，且3‘端自由能最好小于9KJ/mol。 可用oligo 6 软件进行比对看结果的情况。 12.做荧光定量产物长度80-150bp最好，最长是300bp. 13.引物设计避免DNA污染，最好跨外显子接头区。 14.引物与非特异性扩增序列的同源性最好小于70％或者有8个互补碱基同源。 15.查看有无假基因的存在。假基因就是无功能的DNA序列，与需要扩增的目的片段长度相似。 16.TM值在58-62度之间。 这是引物设计原则，但一般不能全部满足这些要求，所以对这些原则要有所取舍 发自小木虫Android客户端 |
2楼2016-10-12 00:38:04
小毛孩24
专家顾问 (职业作家)
-
专家经验: +383 - 应助: 501 (博士)
- 贵宾: 0.029
- 金币: 1459.6
- 散金: 15124
- 红花: 75
- 帖子: 4433
- 在线: 782.9小时
- 虫号: 1230465
- 注册: 2011-03-12
- 专业: 食品科学基础
- 管辖: 食品
3楼2016-10-12 09:36:44
过烟云烟
铁杆木虫 (著名写手)
- 应助: 57 (初中生)
- 金币: 8041.7
- 红花: 21
- 帖子: 1616
- 在线: 354.4小时
- 虫号: 1406756
- 注册: 2011-09-18
- 专业: 躯体感觉、疼痛与镇痛
4楼2016-10-12 09:58:17
