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荧光定量PCR引物设计-新手求助 已有2人参与
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请问如何设计荧光定量PCR的引物？有什么注意事项？ 是不是在NCBI上找到目的基因的序列，然后粘贴到引物设计的软件里，然后就可以生成了？大致流程是这样吧？ 是不是一般定量PCR的引物扩增的片段就100bp左右？ 如果目的基因比较大，是不是只要找其中一个外显子的序列拿去设计就可以了？比方说，我想检测小鼠TLR4的表达水平，NCBI里讲它有25kbp（不知道有没有理解对？），没有直接显示核酸序列，我看map里面它是由几个片段组成的，就拿其中的NM_021297去设计引物，得到一对扩增100bp序列的引物，这样做对吗？ 从来没有做过qPCR，问题比较多，希望大家不吝赐教，谢谢！ |
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引物的具体设计要求： 1.引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。最好位于编码区5’端的300-400bp区域内，可以用DNAman,Alignment 软件 看看结果。 2. 产物不能形成二级结构（自由能小于58.61KJ/mol）。 3.引物长度一般在17-25碱基之间,上下游引物不能相差太大。 4.G+C含量在40%~60%之间，45-55％最佳。 5.碱基要随机分布，尽量均匀。 6.引物自身不能有连续4个碱基的互补。 7.引物之间不能有连续4个碱基的互补。 8.引物5′端可以修饰。 9.3′端不可修饰，而且要避开AT,GC rich的区域，避开T/C,A/G连续结构（2-3个）。 10. 引物3′端要避开密码子的第3位。 11.引物整体设计自由能分布5‘端大于3’端，且3‘端自由能最好小于9KJ/mol。 可用oligo 6 软件进行比对看结果的情况。 12.做荧光定量产物长度80-150bp最好，最长是300bp. 13.引物设计避免DNA污染，最好跨外显子接头区。 14.引物与非特异性扩增序列的同源性最好小于70％或者有8个互补碱基同源。 15.查看有无假基因的存在。假基因就是无功能的DNA序列，与需要扩增的目的片段长度相似。 16.TM值在58-62度之间。 这是引物设计原则，但一般不能全部满足这些要求，所以对这些原则要有所取舍 发自小木虫Android客户端 |
2楼2016-10-12 00:38:04
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