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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 荧光定量PCR引物设计-新手求助
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小毛孩24

专家顾问 (职业作家)

[求助] 荧光定量PCR引物设计-新手求助已有2人参与

请问如何设计荧光定量PCR的引物？有什么注意事项？
是不是在NCBI上找到目的基因的序列，然后粘贴到引物设计的软件里，然后就可以生成了？大致流程是这样吧？
是不是一般定量PCR的引物扩增的片段就100bp左右？
如果目的基因比较大，是不是只要找其中一个外显子的序列拿去设计就可以了？比方说，我想检测小鼠TLR4的表达水平，NCBI里讲它有25kbp（不知道有没有理解对？），没有直接显示核酸序列，我看map里面它是由几个片段组成的，就拿其中的NM_021297去设计引物，得到一对扩增100bp序列的引物，这样做对吗？
从来没有做过qPCR，问题比较多，希望大家不吝赐教，谢谢！
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1楼2016-10-11 23:59:55
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过烟云烟

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-10-12 09:14:31
小毛孩24: 金币+10, ★有帮助 2016-10-12 09:36:52
引物的具体设计要求：
　　1.引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。最好位于编码区5’端的300-400bp区域内，可以用DNAman,Alignment 软件 看看结果。
　　2. 产物不能形成二级结构（自由能小于58.61KJ/mol）。
　　3.引物长度一般在17-25碱基之间,上下游引物不能相差太大。
　　4.G+C含量在40%~60%之间，45-55％最佳。
　　5.碱基要随机分布，尽量均匀。
　　6.引物自身不能有连续4个碱基的互补。
　　7.引物之间不能有连续4个碱基的互补。
　　8.引物5′端可以修饰。
　　9.3′端不可修饰，而且要避开AT,GC rich的区域，避开T/C,A/G连续结构（2-3个）。
　　10. 引物3′端要避开密码子的第3位。
　　11.引物整体设计自由能分布5‘端大于3’端，且3‘端自由能最好小于9KJ/mol。
　　可用oligo 6 软件进行比对看结果的情况。
　　12.做荧光定量产物长度80-150bp最好，最长是300bp.
　　13.引物设计避免DNA污染，最好跨外显子接头区。
　　14.引物与非特异性扩增序列的同源性最好小于70％或者有8个互补碱基同源。
　　15.查看有无假基因的存在。假基因就是无功能的DNA序列，与需要扩增的目的片段长度相似。
　　16.TM值在58-62度之间。
这是引物设计原则，但一般不能全部满足这些要求，所以对这些原则要有所取舍

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once you've accepted your flaws, no one can use them against you.
2楼2016-10-12 00:38:04
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小毛孩24

专家顾问 (职业作家)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 过烟云烟 at 2016-10-12 00:38:04
引物的具体设计要求：
　　1.引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。最好位于编码区5’端的300-400bp区域内，可以用DNAman,Alignment 软件 看看结果。
　　2. 产物不能形成二级结构（自由能小于58.61KJ/mol） ...

非常感谢！这些笼统的概念都知道，希望对特定针对qPCR的引物有更详细的了解。
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3楼2016-10-12 09:36:44
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过烟云烟

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by 小毛孩24 at 2016-10-12 09:36:44
非常感谢！这些笼统的概念都知道，希望对特定针对qPCR的引物有更详细的了解。...

探针退火温度比引物会高一点，其他的和引物差不多，5端不要是G，引物设计基本上可以算作是个经验问题，多设计设计就不用纠结了，说的不对的地方自动跳过啊

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4楼2016-10-12 09:58:17
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爱总是年轻

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
和楼主一样，刚开始接触荧光定量PCR，很多问题不懂，求大神指教。
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总有人要赢，为什么那个不能是我
5楼2016-10-13 15:26:32
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Xuanxuan

新虫 (初入文坛)
帮顶

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6楼2016-10-13 16:26:52
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雨田小子

铁杆木虫 (著名写手)
我也有同样的疑惑，顶上去。
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只要努力，就可以飞的更高~！
7楼2016-10-18 11:32:48
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hey_01

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 过烟云烟 at 2016-10-12 00:38:04
引物的具体设计要求：
　　1.引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。最好位于编码区5’端的300-400bp区域内，可以用DNAman,Alignment 软件 看看结果。
　　2. 产物不能形成二级结构（自由能小于58.61KJ/mol） ...

你好，想请教下我设计了21个碱基长的引物，blast之后发现和基因组里别的基因mRNA有13个碱基的一致，这样的引物还有可能用吗？

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8楼2016-11-15 00:42:09
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过烟云烟

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by hey_01 at 2016-11-15 00:42:09
你好，想请教下我设计了21个碱基长的引物，blast之后发现和基因组里别的基因mRNA有13个碱基的一致，这样的引物还有可能用吗？
...

不能用的

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once you've accepted your flaws, no one can use them against you.
9楼2016-11-15 01:14:42
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