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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 层析/纯化 » 就是纯化不出来
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凯伦爱佳佳

金虫 (正式写手)

[求助] 就是纯化不出来已有4人参与

包涵体蛋白。
透析之前检测有条带，透析之后检测有条带，过柱子之后检测无条带，证明蛋白已经挂在了GST柱子上。
用elution buf+谷胱甘肽 洗脱，检测，什么都没有？？？？？没洗掉？浓度低？
往后想做western，蛋白搞不出来，好急啊
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1楼2016-06-19 22:08:16
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hc-material

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
洗脱液谷胱甘肽浓度在提高点。还洗不下来，降低洗脱液PH洗，降到3.0，祝顺利
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2楼2016-06-20 10:58:50
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wochong

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
蛋白纯化没有蛋白几点原因分析：
（1） 超声功率不对 太大 蛋白炭化 太小 蛋白没有完全释放；策略改变超声功率 超声前加入溶菌酶；
（2）样品或者是结合缓冲液不正确   策略：检测 pH 及样品和结合缓冲液的组成份（EDTA）。
（3）组氨酸的标签没有完全的暴露   策略：在变性条件下(用 8M 脲，6M 盐酸胍,1%SDS) 并加入 1-2mMDTT 进行纯化。
（4）His 标签丢失,策略 1：WB 或者 anti-his 的抗体检查 His 是否表达，上游构建，改变his-tag 的位(C-terminal or N-terminal)，必要时增加 his 个数(常用 6-10 个)。
策略 2：孵育的时间不够，降低流速和增加孵育的时间。
策略 3：改变螯合的金属离子，寻找到最佳的结合金属离子。

更多蛋白纯化问题可见：蛋白纯化系统专题

Ni2+通常是从宿主细胞蛋白中纯化大多数(组氨酸)6 标记的重组蛋白质的首选金属离子，也是一般最常用的离子。蛋白和金属离子之间的结合强度受几种因素影响，包括长度、位置、亲和标记在蛋白的暴露程度、所用离子的类型、以及缓冲液的 pH，因此一些蛋白用其他离子可能更容易地进行纯化而不用 Ni2+。可以利用 Hitrap IMACHP 来筛选不同的金属离子，
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3楼2016-06-20 16:56:50
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凯伦爱佳佳

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by wochong at 2016-06-20 16:56:50
蛋白纯化没有蛋白几点原因分析：
（1） 超声功率不对 太大 蛋白炭化 太小 蛋白没有完全释放；策略改变超声功率 超声前加入溶菌酶；
（2）样品或者是结合缓冲液不正确   策略：检测 pH 及样品和结合缓冲液的组成份 ...

亲，你知道gst标签的么，我不是his标签的蛋白

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4楼2016-06-20 17:29:10
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earth

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
把谷胱甘肽的pH值调到pH8.0，10mM洗脱。
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5楼2016-06-22 15:36:21
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凯伦爱佳佳

金虫 (正式写手)
我就是ph8谷胱甘肽10mM的，有木有什么小细节？ @hc-material

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6楼2016-06-22 16:37:27
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hc-material

专家顾问 (职业作家)
加到400mM洗脱，

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7楼2016-06-22 17:05:27
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walking dead

金虫 (小有名气)

填料制备和蛋白纯化专家

【答案】应助回帖

试试下面的。平衡（洗涤液）50mM  Tris-Hcl（PH=8.3）的配制：0.1M  Tris溶液50ml，加0.1M  盐酸20ml  0.9g Nacl，加水至100ml；（这里面加盐是为了避免离子作用吸附）
洗脱液  50mM Tris-Hcl+还原型谷胱甘肽（PH=8.3）的配制：0.1M  Tris溶液50ml，0.614g还原型谷胱甘肽，然后用0.1M  盐酸调PH=8.3，加水到100ml。
注意：还原型谷胱甘肽容易氧化，需随配随用，所以缓冲液不要配的太多，根据自己情况配。
忘顺利。

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8楼2016-06-23 14:45:17
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20081118129

新虫 (著名写手)

Drake
引用回帖:
8楼: Originally posted by walking dead at 2016-06-23 14:45:17
试试下面的。平衡（洗涤液）50mM  Tris-Hcl（PH=8.3）的配制：0.1M  Tris溶液50ml，加0.1M  盐酸20ml  0.9g Nacl，加水至100ml；（这里面加盐是为了避免离子作用吸附）
洗脱液  50mM Tris-Hcl+还原型谷胱甘肽（PH=8 ...

你好！我在做GST pull-down实验，有问题想咨询你，希望你能帮助我，谢谢！
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9楼2016-06-24 20:26:00
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20081118129

新虫 (著名写手)

Drake
引用回帖:
8楼: Originally posted by walking dead at 2016-06-23 14:45:17
试试下面的。平衡（洗涤液）50mM  Tris-Hcl（PH=8.3）的配制：0.1M  Tris溶液50ml，加0.1M  盐酸20ml  0.9g Nacl，加水至100ml；（这里面加盐是为了避免离子作用吸附）
洗脱液  50mM Tris-Hcl+还原型谷胱甘肽（PH=8 ...

你好！我在做GST pull-down实验，有问题想咨询你，希望你能帮助我，谢谢！
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10楼2016-06-24 20:26:14
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