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终朝采露

新虫 (初入文坛)

[求助] NI柱纯化,杂质挥之不去已有1人参与

各位大师,不多说,先谢谢,直接上主题:
GE 1mlHis trap预装柱,第二次使用。akta系统
wash buffer 含0.5M Nacl 10mM 咪唑,ph 7.4.
elution buffer 0.5M Nacl 500mM 咪唑,ph 7.4.
蛋白为大肠杆菌表达可溶蛋白,破碎后离心上清上样(问题 1. 直接用 wash buffer 重悬菌体后破碎是否可以?是否需要加一些detergent或PMSF。) 流速0.5ml/min 左右。
洗脱问题来了,各组分收集后 sds-page电泳如图,目的蛋白在32kd左右,杂蛋白太多了,感觉完全没有分离的效果。(问题2,每个梯度收集量多大比较合适?比如5%梯度紫外拖尾下降的很慢,是否需要等紫外降到一个水平值,再开启10%?这次收集各梯度之间的洗杂没有很充分,是否是这个原因?本人都手动梯度洗脱)
问题3。后续纯化该如何改进?目的 纯度优先,产量第二。在不用离子和凝胶柱的前提下,这个Ni柱是否不适合该蛋白。
问题4. 我的电泳胶下面1-2cm感觉下不去是什么原因?每次跑完都和上面的颜色不一样,分离胶15%浓度
实验新手,诚心向各位讨教,请知无不言。谢谢!
   第一次发帖,发现金币不够。真想把问题一次写出来,先说下我的感受,据上面说该蛋白his标签在N端和C端都有,做过ELISA,有显色反应。但纯化感觉就是蛋白和杂蛋白一起挂在柱子上,目的蛋白和杂蛋白一起洗脱,梯度难分开。

NI柱纯化,杂质挥之不去
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青春是一本太仓促的书;
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myheat

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
如果his切除不影响后续实验的话。建议重新构建n端his tag 加tev酶切位点。通过ni 和reload ni 就可以达到高纯度。或者使用co柱试试。

[ 发自小木虫客户端 ]
2楼2014-11-12 17:26:27
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lijing1212

禁虫 (初入文坛)

本帖内容被屏蔽

3楼2015-01-21 11:09:54
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pnkyh

铁虫 (小有名气)

我也刚学镍柱纯化。没试过直接用wash buffer重悬,重悬液的盐浓度和wash buffer的有差别,我们实验室有加PMSF。不过既然已经挂上柱子了应该不是这原因吧,提高点咪唑浓度看看杂蛋白会不会少些
4楼2015-01-21 14:55:21
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