| 查看: 1245 | 回复: 3 | |||
[求助]
NI柱纯化，杂质挥之不去 已有1人参与
|
|
各位大师，不多说，先谢谢，直接上主题： GE 1mlHis trap预装柱，第二次使用。akta系统 wash buffer 含0.5M Nacl 10mM 咪唑，ph 7.4. elution buffer 0.5M Nacl 500mM 咪唑，ph 7.4. 蛋白为大肠杆菌表达可溶蛋白，破碎后离心上清上样（问题 1. 直接用 wash buffer 重悬菌体后破碎是否可以？是否需要加一些detergent或PMSF。） 流速0.5ml/min 左右。 洗脱问题来了，各组分收集后 sds-page电泳如图，目的蛋白在32kd左右，杂蛋白太多了，感觉完全没有分离的效果。（问题2，每个梯度收集量多大比较合适？比如5%梯度紫外拖尾下降的很慢，是否需要等紫外降到一个水平值，再开启10%？这次收集各梯度之间的洗杂没有很充分，是否是这个原因？本人都手动梯度洗脱） 问题3。后续纯化该如何改进？目的 纯度优先，产量第二。在不用离子和凝胶柱的前提下，这个Ni柱是否不适合该蛋白。 问题4. 我的电泳胶下面1-2cm感觉下不去是什么原因？每次跑完都和上面的颜色不一样，分离胶15%浓度 实验新手，诚心向各位讨教，请知无不言。谢谢！ 第一次发帖，发现金币不够。真想把问题一次写出来，先说下我的感受，据上面说该蛋白his标签在N端和C端都有，做过ELISA，有显色反应。但纯化感觉就是蛋白和杂蛋白一起挂在柱子上，目的蛋白和杂蛋白一起洗脱，梯度难分开。  37548100.jpg |
回复此楼» 猜你喜欢
需要合成515-64-0，50g，能接单的留言
已经有5人回复
-
上海工程技术大学【激光智能制造】课题组招收硕士
已经有6人回复
-
带资进组求博导收留
已经有11人回复
-
自荐读博
已经有5人回复
-
求个博导看看
已经有16人回复
-
上海工程技术大学张培磊教授团队招收博士生
已经有4人回复
-
求助院士们，这个如何合成呀
已经有4人回复
-
临港实验室与上科大联培博士招生1名
已经有9人回复
-
写了一篇“相变储能技术在冷库中应用”的论文，论文内容以实验为主，投什么期刊合适？
已经有6人回复
-
最近几年招的学生写论文不引自己组发的文章
已经有11人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 分析版2014年度5月份活动主题1--分析前处理经验交流和问题会诊
已经有35人回复
- 蛋白纯化Ni-IDA柱子出现问题
已经有20人回复
- 求助：为什么Ni柱再生后纯化蛋白无活性~~~
已经有8人回复
- 蛋白质的Ni柱纯化问题
已经有23人回复
- 请问GE蛋白纯化的Ni柱 其中HP 和 FF有啥区别
已经有6人回复
2楼2014-11-12 17:26:27
lijing1212
禁虫 (初入文坛)
|
本帖内容被屏蔽 |
3楼2015-01-21 11:09:54
4楼2015-01-21 14:55:21