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终朝采露

新虫 (初入文坛)

应助: 0 (幼儿园)
金币: 17.3
帖子: 22
在线: 23.5小时
虫号: 1234070
注册: 2011-03-15
性别: GG
专业: 免疫生物学

[求助] NI柱纯化，杂质挥之不去已有1人参与

各位大师，不多说，先谢谢，直接上主题：
GE 1mlHis trap预装柱，第二次使用。akta系统
wash buffer 含0.5M Nacl 10mM 咪唑，ph 7.4.
elution buffer 0.5M Nacl 500mM 咪唑，ph 7.4.
蛋白为大肠杆菌表达可溶蛋白，破碎后离心上清上样（问题 1. 直接用 wash buffer 重悬菌体后破碎是否可以？是否需要加一些detergent或PMSF。）流速0.5ml/min 左右。
洗脱问题来了，各组分收集后 sds-page电泳如图，目的蛋白在32kd左右，杂蛋白太多了，感觉完全没有分离的效果。（问题2，每个梯度收集量多大比较合适？比如5%梯度紫外拖尾下降的很慢，是否需要等紫外降到一个水平值，再开启10%？这次收集各梯度之间的洗杂没有很充分，是否是这个原因？本人都手动梯度洗脱）
问题3。后续纯化该如何改进？目的纯度优先，产量第二。在不用离子和凝胶柱的前提下，这个Ni柱是否不适合该蛋白。
问题4. 我的电泳胶下面1-2cm感觉下不去是什么原因？每次跑完都和上面的颜色不一样，分离胶15%浓度
实验新手，诚心向各位讨教，请知无不言。谢谢！
第一次发帖，发现金币不够。真想把问题一次写出来，先说下我的感受，据上面说该蛋白his标签在N端和C端都有，做过ELISA，有显色反应。但纯化感觉就是蛋白和杂蛋白一起挂在柱子上，目的蛋白和杂蛋白一起洗脱，梯度难分开。

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