【答案】应助回帖

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1楼 2016-05-31 17:19:29

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上官abc

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2楼: Originally posted by 221345 at 2016-05-31 22:11:45
步骤没啥问题，确定载体构建没问题？IPTG浓度有没有做过梯度？

上一张图片尴尬了...

3.png

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9楼2016-06-01 11:52:22

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jiuzi59

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你的是不是ATG没有注意到，Nde1也有个ATG，目的基因也有ATG，这个要注意了。你最好把上游引物发过来看看就知道了。

4楼2016-06-01 10:21:22

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上官abc

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8楼: Originally posted by hc-material at 2016-06-01 11:36:03
诱导条件多摸摸。祝顺利

是诱导条件的问题吗？我担心这个基因本身就没法表达蛋白.....

10楼2016-06-01 11:54:05

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jiuzi59

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13楼: Originally posted by 上官abc at 2016-06-01 14:34:36
是BamH 1,不是Nde 1，之前是我搞错了。这个是我自己测得的全长，基因优化是什么？

...

你的基因来源于哪里，不同物种之间的基因在大肠中表达的话，需要做密码子优化。

14楼2016-06-01 14:44:56

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wj2423311236

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建议你查查同类基因文献，看看基因本身是否有问题，我最近的基因也没有表达出来，现在在差文献，初步怀疑是信号肽的问题

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16楼2016-06-01 16:10:36

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ttszero

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原核表达不难，我用的是pet32a的载体，不清楚pet30的，注意下插入序列是否有移码，有些酶切位点在设计上就是移码的，要补碱基，注意下酶切位点有没有把载体上rbs序列切掉，没了这段除非高表达的，一般也不会出条带

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32楼2016-06-02 07:21:26

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221345

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步骤没啥问题，确定载体构建没问题？IPTG浓度有没有做过梯度？

2楼2016-05-31 22:11:45

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Liumengya

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没试试rostaa（拼写不是很对）

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3楼2016-05-31 22:37:20

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上官abc

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4楼: Originally posted by jiuzi59 at 2016-06-01 10:21:22
你的是不是ATG没有注意到，Nde1也有个ATG，目的基因也有ATG，这个要注意了。你最好把上游引物发过来看看就知道了。

S: GGGGTACCATGGAGTTTTTGGGTCTCGGCGAT
AS: CGGGATCCTGCTACCACGAAAGCACTAGATG
酶切位点分别为Kpn1 和BamH 1。
这个是部分全长，中间就用~~代替了。ATGGAGTTTTTGGGTCTCGGCGATAACAAGGTTCGGAGAACTTATGGAGCTTTGTGGTTCAAAATCGTA~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~GAGTCTGGTGGGATCGATTCGCCACTTTACAGGTTCATCTAGTGCTTTCGTGGTAGCATAA
你帮我看看引物没问题吧，谢谢了。

5楼2016-06-01 10:35:44

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上官abc

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3楼: Originally posted by Liumengya at 2016-05-31 22:37:20
没试试rostaa（拼写不是很对）

额，我用的全式金的，说明书上是这么写的，我就这么认为的呢，受教了

6楼2016-06-01 10:37:00

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2楼: Originally posted by 221345 at 2016-05-31 22:11:45
步骤没啥问题，确定载体构建没问题？IPTG浓度有没有做过梯度？

应该没问题，质粒重组后菌液PCR和T7验证是没问题的；IPTG还没做过梯度，一直是用1 mmol/L的浓度，IPTG浓度对蛋白表达影响大吗？

图片2.png

7楼2016-06-01 10:51:08

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hc-material

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