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上官abc金虫 (正式写手)
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用了三种菌还是表达不出蛋白 已有12人参与
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蛋白质表达不出来。用的是pET30a载体，菌用的是BL21、C43和Transetta。目的基因A长度在2400bp左右，蛋白质分子量在93KDa左右，酶切位点为Kpn 1和Nde 1。重组的质粒导入DH5a后菌液PCR和T7验证成功。 400μL菌液加入50m LB培养基，摇到OD值0.4~0.6，取20mL作为对照，剩下的加入IPTG诱导，每隔2小时取样一次，取到第10小时。 蛋白电泳中条带都不是很深，表明大肠杆菌整体表达不高。最关键的是90KDa左右没有特异性条带。下图为BL21和C43蛋白电泳图。 我想请问下广大虫友，我的步骤有没有问题？问题出现在哪？我下一步该怎么进行？万分感谢！  图片1.png |
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9楼2016-06-01 11:52:22
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10楼2016-06-01 11:54:05
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14楼2016-06-01 14:44:56
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16楼2016-06-01 16:10:36
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原核表达不难，我用的是pet32a的载体，不清楚pet30的，注意下插入序列是否有移码，有些酶切位点在设计上就是移码的，要补碱基，注意下酶切位点有没有把载体上rbs序列切掉，没了这段除非高表达的，一般也不会出条带 发自小木虫IOS客户端 |
32楼2016-06-02 07:21:26
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