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radom

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
25楼: Originally posted by 上官abc at 2016-06-01 19:18:16
蛋白质表达不出来,可以先考虑这些吗?不是很懂,望赐教!...

我们用pet28a,做包涵体表达,如果常规诱导表达未表达,用自动诱导,具体操作是37度,24h,需要现配制培养基里面有乳糖 微量元素 缓冲液 盐等等,你可以查查
41楼2016-06-02 17:25:20
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北漂叫花子

木虫 (著名写手)

航空发动机

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
同求,我也不是很明白

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自娱自乐不交税
42楼2016-06-02 17:40:28
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蘑菇卷

新虫 (初入文坛)

你蛋白原来是哪种菌里表达的?

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43楼2016-06-02 19:09:04
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Bioexperixgs

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
先用25摄氏度低温诱导过夜,IPTG中浓度为0.5-1.0mM之间。先看一下有没有表达。融合蛋白有没有毒性,可能表达量低,可以用WB检测一下。上样前测OD600,根据吸光值计算每一个样品的上样体积。

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44楼2016-06-02 23:22:13
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刘氏响声丸

铁虫 (小有名气)

目的基因是来源哪
还是说是因为移位的问题
45楼2016-06-04 10:50:32
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Cathering_w

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

其实哪步不出结果都是比较正常的,放平心态摸索条件,建议:1考虑是否移码,看看起始密码子对不对,2更换质粒,有些组氨酸尾巴在前有的在后有的都有,3加甘油,有的时候是管用的,4看沉淀中有没,万一只有包涵体怎么办,5加个没连接目的基因的空菌,一致的表达条件,看看有没有差异,6你的蛋白直接大量表达纯化一次,只要表达就好,管它多少,耽误时间实验进程
祝好运

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博士终于毕业了,未来还有什么困难能难得倒我呢!加油我得未来。
46楼2016-06-04 12:50:47
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tmoonday

金虫 (小有名气)

一个,查一下是否是膜蛋白,是否有夸膜区。第二是,建议用pGEX系列载体试一下,GST标签促融。

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等一份缘分
47楼2016-06-04 20:11:04
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15113546664

新虫 (初入文坛)

质粒载体验证成功?我觉得可以考虑再做一下质粒载体,

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48楼2016-06-05 00:05:45
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miega

银虫 (小有名气)

请问你T7验证用的是什么引物,你确定重组载体构建成功了吗?

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49楼2016-06-05 19:29:20
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CarolChan

新虫 (初入文坛)

我和楼主遇到了一样的问题,一个936bp也就是35kD左右的片段,不管是和pET28a还是pMAL-C2X载体连接,宿主菌也换过BL21(DE3)、TB1和Transetta,怎样都是不表达。也做过诱导条件优化,改变诱导时间、温度和IPTG浓度,但都没有什么效果。不知道楼主现在问题解决了没,如果解决了希望能分享一下解决方法。多谢
50楼2016-06-05 20:46:43
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