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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 用了三种菌还是表达不出蛋白
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上官abc

金虫 (正式写手)

王下七武海

[求助] 用了三种菌还是表达不出蛋白 已有12人参与

蛋白质表达不出来。用的是pET30a载体，菌用的是BL21、C43和Transetta。目的基因A长度在2400bp左右，蛋白质分子量在93KDa左右，酶切位点为Kpn 1和Nde 1。重组的质粒导入DH5a后菌液PCR和T7验证成功。
400μL菌液加入50m LB培养基，摇到OD值0.4~0.6，取20mL作为对照，剩下的加入IPTG诱导，每隔2小时取样一次，取到第10小时。
蛋白电泳中条带都不是很深，表明大肠杆菌整体表达不高。最关键的是90KDa左右没有特异性条带。下图为BL21和C43蛋白电泳图。
我想请问下广大虫友，我的步骤有没有问题？问题出现在哪？我下一步该怎么进行？万分感谢！

用了三种菌还是表达不出蛋白
图片1.png
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1楼 2016-05-31 17:19:29
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上官abc

金虫 (正式写手)

王下七武海
引用回帖:
2楼: Originally posted by 221345 at 2016-05-31 22:11:45
步骤没啥问题，确定载体构建没问题？IPTG浓度有没有做过梯度？

上一张图片尴尬了...
用了三种菌还是表达不出蛋白-1
3.png
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9楼2016-06-01 11:52:22
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jiuzi59

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰·手有余香，谢谢你的理解与支持。myprayer祝您科研顺利，文章多多。 2016-06-02 21:53:02
你的是不是ATG没有注意到，Nde1也有个ATG，目的基因也有ATG，这个要注意了。你最好把上游引物发过来看看就知道了。
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4楼2016-06-01 10:21:22
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上官abc

金虫 (正式写手)

王下七武海
引用回帖:
8楼: Originally posted by hc-material at 2016-06-01 11:36:03
诱导条件多摸摸。祝顺利

是诱导条件的问题吗？我担心这个基因本身就没法表达蛋白.....
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10楼2016-06-01 11:54:05
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jiuzi59

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
13楼: Originally posted by 上官abc at 2016-06-01 14:34:36
是BamH 1,不是Nde 1，之前是我搞错了。这个是我自己测得的全长，基因优化是什么？...

你的基因来源于哪里，不同物种之间的基因在大肠中表达的话，需要做密码子优化。
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14楼2016-06-01 14:44:56
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wj2423311236

银虫 (小有名气)
建议你查查同类基因文献，看看基因本身是否有问题，我最近的基因也没有表达出来，现在在差文献，初步怀疑是信号肽的问题

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16楼2016-06-01 16:10:36
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ttszero

新虫 (小有名气)
原核表达不难，我用的是pet32a的载体，不清楚pet30的，注意下插入序列是否有移码，有些酶切位点在设计上就是移码的，要补碱基，注意下酶切位点有没有把载体上rbs序列切掉，没了这段除非高表达的，一般也不会出条带

发自小木虫IOS客户端
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32楼2016-06-02 07:21:26
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普通回帖

221345

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰·手有余香，谢谢你的理解与支持。myprayer祝您科研顺利，文章多多。 2016-06-02 21:53:17
步骤没啥问题，确定载体构建没问题？IPTG浓度有没有做过梯度？
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2楼2016-05-31 22:11:45
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Liumengya

木虫 (正式写手)
没试试rostaa（拼写不是很对）

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3楼2016-05-31 22:37:20
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上官abc

金虫 (正式写手)

王下七武海
引用回帖:
4楼: Originally posted by jiuzi59 at 2016-06-01 10:21:22
你的是不是ATG没有注意到，Nde1也有个ATG，目的基因也有ATG，这个要注意了。你最好把上游引物发过来看看就知道了。

S:    GGGGTACCATGGAGTTTTTGGGTCTCGGCGAT
AS:  CGGGATCCTGCTACCACGAAAGCACTAGATG
酶切位点分别为Kpn1 和BamH 1。
这个是部分全长，中间就用~~代替了。ATGGAGTTTTTGGGTCTCGGCGATAACAAGGTTCGGAGAACTTATGGAGCTTTGTGGTTCAAAATCGTA~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~GAGTCTGGTGGGATCGATTCGCCACTTTACAGGTTCATCTAGTGCTTTCGTGGTAGCATAA
你帮我看看引物没问题吧，谢谢了。
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5楼2016-06-01 10:35:44
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上官abc

金虫 (正式写手)

王下七武海
引用回帖:
3楼: Originally posted by Liumengya at 2016-05-31 22:37:20
没试试rostaa（拼写不是很对）

额，我用的全式金的，说明书上是这么写的，我就这么认为的呢，受教了
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6楼2016-06-01 10:37:00
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上官abc

金虫 (正式写手)

王下七武海
引用回帖:
2楼: Originally posted by 221345 at 2016-05-31 22:11:45
步骤没啥问题，确定载体构建没问题？IPTG浓度有没有做过梯度？

应该没问题，质粒重组后菌液PCR和T7验证是没问题的；IPTG还没做过梯度，一直是用1 mmol/L的浓度，IPTG浓度对蛋白表达影响大吗？
用了三种菌还是表达不出蛋白-2
图片2.png
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7楼2016-06-01 10:51:08
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hc-material

专家顾问 (职业作家)
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 应助指数-1, 非应助内容请勿占用应助指数，，赠人玫瑰·手有余香，谢谢你的理解与支持，祝您科研顺利，文章多多。 2016-06-02 21:53:36
诱导条件多摸摸。祝顺利
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8楼2016-06-01 11:36:03
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