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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 想让大肠杆菌表达它原来没有的蛋白，是不是必需先构建克隆载体再构建表达载体？
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圆加leaf

新虫 (小有名气)

[交流] 想让大肠杆菌表达它原来没有的蛋白，是不是必需先构建克隆载体再构建表达载体？

本人想转一个新的基因进大肠杆菌，让他表达原来没有的一种蛋白，研究它的代谢量。
方式是靠构建质粒，可是又看到有基因克隆载体，和表达载体，有点懵了，我是不是需要先用一个克隆载体，转化进感受态细胞，让他复制，然后再提这个基因，再用这基因构建一个表达载体，再转进细胞，然后才可以稳定表达，研究代谢？！
请各位前辈指导！！
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1楼 2016-03-30 09:57:03
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MarchZR

银虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★
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圆加leaf: 金币+4, 非常感谢！ 2016-03-30 13:41:53
姑娘不需要，直接构建表达载体就行，参考大肠杆菌蛋白表达操作流程步骤原理：http://www.detaibio.com/topics/dachangganjunbiaodaliucheng-sop.html
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3楼2016-03-30 10:27:50
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MT233

新虫 (初入文坛)
★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
圆加leaf: 金币+4 2016-04-01 11:18:00
我基本上都是一步到位，直接到表达载体，表达菌种！然后测个序就ok了！前后估计做了百多个，木有问题！

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7楼2016-04-01 01:03:27
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sihaiming

铜虫 (初入文坛)
★ ★ ★ ★ ★
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圆加leaf: 金币+4 2016-03-30 13:39:50
没必要，你说的克隆载体是想获得更多的目的基因吗？还是想干嘛？你只需要将目的片段连接到表达质粒上就好了，你不用管大肠里有没有你的基因。主要看你的载体在大肠里能不能表达。比如启动子合不合适，你要用的大肠是哪个BL21还是JM109还是什么，不同菌株配不同表达载体
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2楼2016-03-30 10:21:03
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原海亮

木虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
圆加leaf: 金币+4 2016-03-30 13:42:18
其实克隆载体的概念太大也模糊，本身表达载体就是一个普通的克隆载体呀，只不过它本身经过改造了，相对其他克隆载体，在蛋白表达方面更有优势，但基本的克隆载体功能它也具有。

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天空才是极限，我有信心飞的更高！
4楼2016-03-30 12:24:49
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圆加leaf

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by sihaiming at 2016-03-30 10:21:03
没必要，你说的克隆载体是想获得更多的目的基因吗？还是想干嘛？你只需要将目的片段连接到表达质粒上就好了，你不用管大肠里有没有你的基因。主要看你的载体在大肠里能不能表达。比如启动子合不合适，你要用的大肠是 ...

谢谢，我是想让大肠杆菌表达出原本没有的蛋白，这样才能产出新的东西，这样只要表达载体就好了吧？我想用BL21，是不是就要用pET系列的载体？
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5楼2016-03-30 13:41:13
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I-Believe

新虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★
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圆加leaf: 金币+4 2016-04-01 11:15:11
引用回帖:
5楼: Originally posted by 圆加leaf at 2016-03-30 13:41:13
谢谢，我是想让大肠杆菌表达出原本没有的蛋白，这样才能产出新的东西，这样只要表达载体就好了吧？我想用BL21，是不是就要用pET系列的载体？...

pET可以，但是大肠杆菌表达后一般目的蛋白都是以包涵体状态聚集，没有正确折叠，就没有活性。

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6楼2016-03-31 15:01:46
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圆加leaf

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by I-Believe at 2016-03-31 15:01:46
pET可以，但是大肠杆菌表达后一般目的蛋白都是以包涵体状态聚集，没有正确折叠，就没有活性。
...

对不起，难得碰见大神，抱大腿啰嗦问下：1、没有活性？那是不是生产能力较弱？主要是用来生物工程产出一个指定代谢物的啊……；2、pET的载体，用JM109感受态细胞效果如何？因为想用K-12系的菌株，方便预测知道生产
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8楼2016-04-01 11:17:46
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圆加leaf

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by MT233 at 2016-04-01 01:03:27
我基本上都是一步到位，直接到表达载体，表达菌种！然后测个序就ok了！前后估计做了百多个，木有问题！

用pET然后转到JM109感受态细胞，效果怎么样？测序你一般是再把质粒提出来拿去测还是提什么去测比较准？不好意思，啰嗦问多一句~
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9楼2016-04-01 11:19:25
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I-Believe

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
8楼: Originally posted by 圆加leaf at 2016-04-01 11:17:46
对不起，难得碰见大神，抱大腿啰嗦问下：1、没有活性？那是不是生产能力较弱？主要是用来生物工程产出一个指定代谢物的啊……；2、pET的载体，用JM109感受态细胞效果如何？因为想用K-12系的菌株，方便预测知道生产...

额不是大神，只是略懂皮毛。
pET表达你的目的蛋白特异性很强的，表达量大速度快，所以会形成包涵体，导致没活性。
感受态细胞可以用于构建你的载体，不用于表达。表达宿主菌商业化的有BL21，ROSETTA等。

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10楼2016-04-01 15:41:22
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