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圆加leaf

新虫 (小有名气)

[交流] 想让大肠杆菌表达它原来没有的蛋白,是不是必需先构建克隆载体再构建表达载体?

本人想转一个新的基因进大肠杆菌,让他表达原来没有的一种蛋白,研究它的代谢量。
方式是靠构建质粒,可是又看到有基因克隆载体,和表达载体,有点懵了,我是不是需要先用一个克隆载体,转化进感受态细胞,让他复制,然后再提这个基因,再用这基因构建一个表达载体,再转进细胞,然后才可以稳定表达,研究代谢?!
请各位前辈指导!!
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圆加leaf

新虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by I-Believe at 2016-03-31 15:01:46
pET可以,但是大肠杆菌表达后一般目的蛋白都是以包涵体状态聚集,没有正确折叠,就没有活性。
...

对不起,难得碰见大神,抱大腿啰嗦问下:1、没有活性?那是不是生产能力较弱?主要是用来生物工程产出一个指定代谢物的啊……;2、pET的载体,用JM109感受态细胞效果如何?因为想用K-12系的菌株,方便预测知道生产
8楼2016-04-01 11:17:46
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sihaiming

铜虫 (初入文坛)

★ ★ ★ ★ ★
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圆加leaf: 金币+4 2016-03-30 13:39:50
没必要,你说的克隆载体是想获得更多的目的基因吗?还是想干嘛?你只需要将目的片段连接到表达质粒上就好了,你不用管大肠里有没有你的基因。主要看你的载体在大肠里能不能表达。比如启动子合不合适,你要用的大肠是哪个BL21还是JM109还是什么,不同菌株配不同表达载体
2楼2016-03-30 10:21:03
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MarchZR

银虫 (小有名气)

★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
圆加leaf: 金币+4, 非常感谢! 2016-03-30 13:41:53
姑娘不需要,直接构建表达载体就行,参考大肠杆菌蛋白表达操作流程步骤原理:http://www.detaibio.com/topics/dachangganjunbiaodaliucheng-sop.html
3楼2016-03-30 10:27:50
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原海亮

木虫 (著名写手)

★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
圆加leaf: 金币+4 2016-03-30 13:42:18
其实克隆载体的概念太大也模糊,本身表达载体就是一个普通的克隆载体呀,只不过它本身经过改造了,相对其他克隆载体,在蛋白表达方面更有优势,但基本的克隆载体功能它也具有。

发自小木虫Android客户端
天空才是极限,我有信心飞的更高!
4楼2016-03-30 12:24:49
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