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mahaidong520

铜虫 (小有名气)

[求助] 请教RT-PCR内参基因正常,目的基因起峰晚,什么原因,RNA正常,引物新和成已有2人参与

请教RT-PCR内参基因正常,目的基因起峰晚,什么原因,RNA正常,引物新和成
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南宫瑾

新虫 (小有名气)

应该是cDNA模板的浓度比较低

发自小木虫Android客户端
2楼2016-03-14 13:02:16
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卡维斯

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
mahaidong520: 金币+3, ★★★很有帮助 2016-03-14 15:10:44
内参正常说明反转录还可以,目的基因起峰晚是说循环数高么?一个可能是基因表达的问题,精细取材;再一个就可能是反转录后的浓度低。
3楼2016-03-14 13:23:53
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卡维斯

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

好吧,我以为你做的半定量呢。。起峰晚可能是表达量比较低。
测得浓度是cDNA?这个不用测吧,反转录完成后用内参基因标模板使Ct值一致。按你的操作是稀释了10倍。


另外扩增曲线显示如果是一个基因的话,从内参的曲线来看表明你的cDNA的的起始浓度不一致,建议各样Ct值差小于0.5。

» 本帖已获得的红花(最新10朵)

8楼2016-03-14 18:53:08
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mahaidong520

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 卡维斯 at 2016-03-14 13:23:53
内参正常说明反转录还可以,目的基因起峰晚是说循环数高么?一个可能是基因表达的问题,精细取材;再一个就可能是反转录后的浓度低。

测得浓度在300-700ng/ul,后稀释成30-70ng/ul,加模板为3ul,照说明书应在100ng内,正常的话浓度不会低吧,起峰都在35个循环后了,内参基因都在20-24个循环内起峰,我再把浓度提高点试试,谢谢
4楼2016-03-14 15:10:27
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yvonne9044

新虫 (正式写手)

5楼2016-03-14 15:59:30
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mahaidong520

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by yvonne9044 at 2016-03-14 15:59:30
认为二楼正解

麻烦帮忙看一下
请教RT-PCR内参基因正常,目的基因起峰晚,什么原因,RNA正常,引物新和成


请教RT-PCR内参基因正常,目的基因起峰晚,什么原因,RNA正常,引物新和成-1



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6楼2016-03-14 16:31:01
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yvonne9044

新虫 (正式写手)

7楼2016-03-14 17:44:48
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mahaidong520

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
8楼: Originally posted by 卡维斯 at 2016-03-14 18:53:08
好吧,我以为你做的半定量呢。。起峰晚可能是表达量比较低。
测得浓度是cDNA?这个不用测吧,反转录完成后用内参基因标模板使Ct值一致。按你的操作是稀释了10倍。


另外扩增曲线显示如果是一个基因的话,从内参 ...

测的是rna浓度,反转后没有测,我在想如果把目的基因的浓度增大,那内参基因浓度也扩大,会不会对起峰有影响

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9楼2016-03-15 08:44:26
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mahaidong520

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
8楼: Originally posted by 卡维斯 at 2016-03-14 18:53:08
好吧,我以为你做的半定量呢。。起峰晚可能是表达量比较低。
测得浓度是cDNA?这个不用测吧,反转录完成后用内参基因标模板使Ct值一致。按你的操作是稀释了10倍。


另外扩增曲线显示如果是一个基因的话,从内参 ...

还有麻烦问一下,怎么样保持起始cdna浓度一致,谢谢

发自小木虫Android客户端
10楼2016-03-15 08:46:06
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