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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 请教RT-PCR内参基因正常，目的基因起峰晚，什么原因，RNA正常，引物新和成
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mahaidong520

铜虫 (小有名气)

[求助] 请教RT-PCR内参基因正常，目的基因起峰晚，什么原因，RNA正常，引物新和成 已有2人参与

请教RT-PCR内参基因正常，目的基因起峰晚，什么原因，RNA正常，引物新和成
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1楼 2016-03-14 11:48:59
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南宫瑾

新虫 (小有名气)
应该是cDNA模板的浓度比较低

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2楼2016-03-14 13:02:16
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卡维斯

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
mahaidong520: 金币+3, ★★★很有帮助 2016-03-14 15:10:44
内参正常说明反转录还可以，目的基因起峰晚是说循环数高么？一个可能是基因表达的问题，精细取材；再一个就可能是反转录后的浓度低。
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3楼2016-03-14 13:23:53
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卡维斯

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

好吧，我以为你做的半定量呢。。起峰晚可能是表达量比较低。
测得浓度是cDNA？这个不用测吧，反转录完成后用内参基因标模板使Ct值一致。按你的操作是稀释了10倍。


另外扩增曲线显示如果是一个基因的话，从内参的曲线来看表明你的cDNA的的起始浓度不一致，建议各样Ct值差小于0.5。
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mahaidong520
8楼2016-03-14 18:53:08
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mahaidong520

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 卡维斯 at 2016-03-14 13:23:53
内参正常说明反转录还可以，目的基因起峰晚是说循环数高么？一个可能是基因表达的问题，精细取材；再一个就可能是反转录后的浓度低。

测得浓度在300-700ng/ul，后稀释成30-70ng/ul，加模板为3ul，照说明书应在100ng内，正常的话浓度不会低吧，起峰都在35个循环后了，内参基因都在20-24个循环内起峰，我再把浓度提高点试试，谢谢
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4楼2016-03-14 15:10:27
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yvonne9044

新虫 (正式写手)
认为二楼正解

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5楼2016-03-14 15:59:30
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mahaidong520

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by yvonne9044 at 2016-03-14 15:59:30
认为二楼正解

麻烦帮忙看一下
请教RT-PCR内参基因正常，目的基因起峰晚，什么原因，RNA正常，引物新和成


请教RT-PCR内参基因正常，目的基因起峰晚，什么原因，RNA正常，引物新和成-1



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6楼2016-03-14 16:31:01
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yvonne9044

新虫 (正式写手)
你的目的基因是什么

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7楼2016-03-14 17:44:48
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mahaidong520

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 卡维斯 at 2016-03-14 18:53:08
好吧，我以为你做的半定量呢。。起峰晚可能是表达量比较低。
测得浓度是cDNA？这个不用测吧，反转录完成后用内参基因标模板使Ct值一致。按你的操作是稀释了10倍。


另外扩增曲线显示如果是一个基因的话，从内参 ...

测的是rna浓度，反转后没有测，我在想如果把目的基因的浓度增大，那内参基因浓度也扩大，会不会对起峰有影响

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9楼2016-03-15 08:44:26
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mahaidong520

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 卡维斯 at 2016-03-14 18:53:08
好吧，我以为你做的半定量呢。。起峰晚可能是表达量比较低。
测得浓度是cDNA？这个不用测吧，反转录完成后用内参基因标模板使Ct值一致。按你的操作是稀释了10倍。


另外扩增曲线显示如果是一个基因的话，从内参 ...

还有麻烦问一下，怎么样保持起始cdna浓度一致，谢谢

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10楼2016-03-15 08:46:06
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