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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 请教RT-PCR内参基因正常，目的基因起峰晚，什么原因，RNA正常，引物新和成
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卡维斯

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by mahaidong520 at 2016-03-15 08:44:26
测的是rna浓度，反转后没有测，我在想如果把目的基因的浓度增大，那内参基因浓度也扩大，会不会对起峰有影响
...

那用的什么试剂盒反转录？感觉100ng有点少，我们是按照2ugRNA算的，即统一稀释成2ug，这样反转后cDNA的浓度基本是差不多的，Ct值差异还是控制在0.5以内。目的基因和内参所用模板应该是同一个。
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11楼2016-03-15 10:19:00
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mahaidong520

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
11楼: Originally posted by 卡维斯 at 2016-03-15 10:19:00
那用的什么试剂盒反转录？感觉100ng有点少，我们是按照2ugRNA算的，即统一稀释成2ug，这样反转后cDNA的浓度基本是差不多的，Ct值差异还是控制在0.5以内。目的基因和内参所用模板应该是同一个。...

谢谢，明天照你的方法做一下，希望能成功

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12楼2016-03-15 12:57:36
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mahaidong520

铜虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
8楼: Originally posted by 卡维斯 at 2016-03-14 18:53:08
好吧，我以为你做的半定量呢。。起峰晚可能是表达量比较低。
测得浓度是cDNA？这个不用测吧，反转录完成后用内参基因标模板使Ct值一致。按你的操作是稀释了10倍。


另外扩增曲线显示如果是一个基因的话，从内参 ...

能在麻烦问一下，你们用的是什么牌子的定量试剂，按照2ul反转后的定量体系是怎么样的，谢谢

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13楼2016-03-15 16:14:48
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a314919473

银虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我们公司按照1微克RNA进行反转，然后得到cDNA稀释8倍作为模板上机。
试剂的话都是我们公司自己的，一直做了那么多年，一直很稳定。
你的内参CT差的比较多，建议重新反转，目的基因我个人建议你重新设计引物。
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有你真好
14楼2016-03-15 16:50:47
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卡维斯

金虫 (正式写手)
引用回帖:
13楼: Originally posted by mahaidong520 at 2016-03-15 16:14:48
能在麻烦问一下，你们用的是什么牌子的定量试剂，按照2ul反转后的定量体系是怎么样的，谢谢
...

天根的，正常的体系呀
2X SYBR GREN    10
F                       1
R                       1
ddH2O               7
cDNA                  1
------------------------------
                         20ul
混大样分装
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15楼2016-03-15 16:54:37
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mahaidong520

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
15楼: Originally posted by 卡维斯 at 2016-03-15 16:54:37
天根的，正常的体系呀
2X SYBR GREN    10
F                       1
R                       1
ddH2O               7
cDNA                  1
------------------------------
                    ...

那就是反转时平衡rna的质量，反转后也不用稀释，直接加1ul的cdna，对吧

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16楼2016-03-15 17:22:18
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卡维斯

金虫 (正式写手)
引用回帖:
16楼: Originally posted by mahaidong520 at 2016-03-15 17:22:18
那就是反转时平衡rna的质量，反转后也不用稀释，直接加1ul的cdna，对吧
...

反转后你得标模板，用内参细微调节。
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17楼2016-03-15 18:17:33
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mahaidong520

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
17楼: Originally posted by 卡维斯 at 2016-03-15 18:17:33
反转后你得标模板，用内参细微调节。...

标模板？不太清楚，怎么做，能麻烦解释下么，谢谢

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18楼2016-03-15 23:36:15
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wampire999

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
10楼: Originally posted by mahaidong520 at 2016-03-15 08:46:06
还有麻烦问一下，怎么样保持起始cdna浓度一致，谢谢
...

测cDNA浓度，然后稀释到相同浓度

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19楼2017-04-20 00:38:48
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