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求助！！短片段（169 bp）PCR扩增，用Takara La Taq酶，不出条带呀。。。。 已有5人参与
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 小白第一次发帖，各位大神见谅。。。。以前用普通的2×Taq PCR Mix扩增，它含的酶是Taq DNA Polymerase，扩增条带是169 bp，当时可以出条带，亮度可以。也送测了的，返回结果有的位点是双峰。 因为提的DNA是混合物，现在想做克隆看看混合物的成分，就换成了Takara的La taq，但是不出条带了呀。。。引物没变，PCR条件也没变。。。。 我的条件是这样的： （1）94℃ 5min （2）94℃ 30s （3）51 ℃ 30s （4）72℃ 45s （5）（2）-（4）39 （6）72℃ 10min （7）4℃ forever 求各位大神帮帮忙，看看有没有啥问题啊。。。。   有啥没说到的，各位大神尽管问。。。。。 |
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2楼2016-03-06 07:24:03
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小胖芙芙6楼2016-03-06 08:46:12
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第一点，双峰的结果是不是你想要的结果？不是的话，麻烦你的引物重新设计，不够特异性，第二点，你可以用高保真酶就可以啊，La酶是长片段扩增用的吧？ 发自小木虫IOS客户端 |
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7楼2016-03-06 09:07:56
原海亮
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【答案】应助回帖
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不到200的片段用普通酶应该可以拿到正确的序列的，突变率还是比较低的，对于你测序是双峰，不知道你送测的样品是什么？测序结果一点正确的都没有？如果是PCR产物，建议将pcr产物进行胶回收或者过柱纯化后测序，另一个办法即将pcr产物连接到T载体测序。另外实验中不同的酶更换后，条件还是要重新摸索的，特别退火温度，因为经常会出现普通酶可以而高保真的酶不行。我不太清楚第二种酶的延伸速度，不到200的片段应该不用那么长延伸时间吧，循环数也适当减少些，祝好！ 发自小木虫Android客户端 |
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8楼2016-03-06 09:12:52
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溶液体系是: LA Taq 0.25微升 pcr buffer 2.5微升 dNTP Mix 2微升 primers 1/1微升 ddH2O 17.25微升 DNA 1微升 对了，LA taq是125U的 发自小木虫Android客户端 |
9楼2016-03-06 10:06:20
10楼2016-03-06 10:16:41
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