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小胖芙芙

新虫 (初入文坛)

送红花一朵
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7楼: Originally posted by 张凡云 at 2016-03-06 09:07:56
第一点,双峰的结果是不是你想要的结果?不是的话,麻烦你的引物重新设计,不够特异性,第二点,你可以用高保真酶就可以啊,La酶是长片段扩增用的吧?

双峰是我想要的,不是所有位点都是双峰,是几个位点是,别的位置是单峰。
然后,以前用LA扩500bp是没有问题的,那现在用别的酶是不是必须要加A尾以后连T载体呢?昨天有人和我说不加A尾也可以直接连,我就有点儿迷糊了。。。
刚开始做,好多不懂的,见谅见谅。。。

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11楼2016-03-06 10:21:03
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张凡云

至尊木虫 (职业作家)

高保真酶是需要重新加A尾的

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12楼2016-03-06 10:23:00
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小胖芙芙

新虫 (初入文坛)

送红花一朵
引用回帖:
8楼: Originally posted by 原海亮 at 2016-03-06 09:12:52
不到200的片段用普通酶应该可以拿到正确的序列的,突变率还是比较低的,对于你测序是双峰,不知道你送测的样品是什么?测序结果一点正确的都没有?如果是PCR产物,建议将pcr产物进行胶回收或者过柱纯化后测序,另一 ...

测序结果不是不正确,是大部分是单峰,在几个位点有套峰,我猜测可能是有近缘种,想做克隆看看。

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13楼2016-03-06 10:37:15
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落雪6

铁杆木虫 (正式写手)

小兵

14楼2016-03-06 10:40:08
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原海亮

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
13楼: Originally posted by 小胖芙芙 at 2016-03-06 10:37:15
测序结果不是不正确,是大部分是单峰,在几个位点有套峰,我猜测可能是有近缘种,想做克隆看看。
...

就几个位点双峰呀,那还达不到你的要求么,我们测序1000里面几百都是杂乱信号不好的杂峰

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天空才是极限,我有信心飞的更高!
15楼2016-03-06 10:42:23
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小胖芙芙

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
15楼: Originally posted by 原海亮 at 2016-03-06 10:42:23
就几个位点双峰呀,那还达不到你的要求么,我们测序1000里面几百都是杂乱信号不好的杂峰
...

不是达不到要求,是那几个位点的双峰可能说明有近缘种,我想做克隆看看

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16楼2016-03-06 16:16:43
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小胖芙芙

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
14楼: Originally posted by 落雪6 at 2016-03-06 10:40:08
引物合适吗?

一直用这个引物,都能出的,只是换了个酶,出不来了

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17楼2016-03-06 16:18:35
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小胖芙芙

新虫 (初入文坛)

各位大神们,我做出来啦,换了个酶,调了个程序,出来了呀。。

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18楼2016-03-06 16:21:21
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游侠892

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
用普通的taq酶扩增就够了,一般突变的频率很低的。要是实在不放心就多测几个克隆。
路漫漫其修远兮,吾将上下而求索
19楼2016-03-08 19:19:46
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jukongka

铁杆木虫 (著名写手)

年度最忠心木虫

【答案】应助回帖

500bp以下短片段,不需要高保真酶,建议你用Takara的 EX Taq,肯定可以。LA Taq 扩增效率不如EX Taq,并且保真度一样
20楼2016-03-10 15:02:13
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