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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 求助！！短片段（169 bp）PCR扩增，用Takara La Taq酶，不出条带呀。。。。
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小胖芙芙

新虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
7楼: Originally posted by 张凡云 at 2016-03-06 09:07:56
第一点，双峰的结果是不是你想要的结果？不是的话，麻烦你的引物重新设计，不够特异性，第二点，你可以用高保真酶就可以啊，La酶是长片段扩增用的吧？

双峰是我想要的，不是所有位点都是双峰，是几个位点是，别的位置是单峰。
然后，以前用LA扩500bp是没有问题的，那现在用别的酶是不是必须要加A尾以后连T载体呢？昨天有人和我说不加A尾也可以直接连，我就有点儿迷糊了。。。
刚开始做，好多不懂的，见谅见谅。。。

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11楼2016-03-06 10:21:03
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张凡云

至尊木虫 (职业作家)
高保真酶是需要重新加A尾的

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12楼2016-03-06 10:23:00
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小胖芙芙

新虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
8楼: Originally posted by 原海亮 at 2016-03-06 09:12:52
不到200的片段用普通酶应该可以拿到正确的序列的，突变率还是比较低的，对于你测序是双峰，不知道你送测的样品是什么？测序结果一点正确的都没有？如果是PCR产物，建议将pcr产物进行胶回收或者过柱纯化后测序，另一 ...

测序结果不是不正确，是大部分是单峰，在几个位点有套峰，我猜测可能是有近缘种，想做克隆看看。

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13楼2016-03-06 10:37:15
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落雪6

铁杆木虫 (正式写手)

小兵
引物合适吗？

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14楼2016-03-06 10:40:08
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原海亮

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
13楼: Originally posted by 小胖芙芙 at 2016-03-06 10:37:15
测序结果不是不正确，是大部分是单峰，在几个位点有套峰，我猜测可能是有近缘种，想做克隆看看。
...

就几个位点双峰呀，那还达不到你的要求么，我们测序1000里面几百都是杂乱信号不好的杂峰

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天空才是极限，我有信心飞的更高！
15楼2016-03-06 10:42:23
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小胖芙芙

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
15楼: Originally posted by 原海亮 at 2016-03-06 10:42:23
就几个位点双峰呀，那还达不到你的要求么，我们测序1000里面几百都是杂乱信号不好的杂峰
...

不是达不到要求，是那几个位点的双峰可能说明有近缘种，我想做克隆看看

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16楼2016-03-06 16:16:43
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小胖芙芙

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
14楼: Originally posted by 落雪6 at 2016-03-06 10:40:08
引物合适吗？

一直用这个引物，都能出的，只是换了个酶，出不来了

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17楼2016-03-06 16:18:35
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小胖芙芙

新虫 (初入文坛)
各位大神们，我做出来啦，换了个酶，调了个程序，出来了呀。。

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18楼2016-03-06 16:21:21
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游侠892

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
用普通的taq酶扩增就够了，一般突变的频率很低的。要是实在不放心就多测几个克隆。
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路漫漫其修远兮，吾将上下而求索
19楼2016-03-08 19:19:46
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jukongka

铁杆木虫 (著名写手)

年度最忠心木虫

【答案】应助回帖

500bp以下短片段，不需要高保真酶，建议你用Takara的 EX Taq，肯定可以。LA Taq 扩增效率不如EX Taq，并且保真度一样
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20楼2016-03-10 15:02:13
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