| 查看: 4197 | 回复: 20 | ||
[求助]
求助！！短片段（169 bp）PCR扩增，用Takara La Taq酶，不出条带呀。。。。 已有5人参与
|
 小白第一次发帖，各位大神见谅。。。。以前用普通的2×Taq PCR Mix扩增，它含的酶是Taq DNA Polymerase，扩增条带是169 bp，当时可以出条带，亮度可以。也送测了的，返回结果有的位点是双峰。 因为提的DNA是混合物，现在想做克隆看看混合物的成分，就换成了Takara的La taq，但是不出条带了呀。。。引物没变，PCR条件也没变。。。。 我的条件是这样的： （1）94℃ 5min （2）94℃ 30s （3）51 ℃ 30s （4）72℃ 45s （5）（2）-（4）39 （6）72℃ 10min （7）4℃ forever 求各位大神帮帮忙，看看有没有啥问题啊。。。。   有啥没说到的，各位大神尽管问。。。。。 |
回复此楼» 猜你喜欢
含氟糖皮质激素的外用抗炎利器醋酸氟轻松
已经有0人回复
-
阿莫奈韦（Amenamevir）：解旋酶-引物酶靶向分子的结构特征与合成路径全解析
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有230人回复
-
利瑞鲁单抗：靶向KIR的NK细胞检查点工具抗体，结构基础与科研应用全解析
已经有0人回复
-
Wnt-C59：PORCN靶向化学探针，Wnt信号通路阻断机制与科研应用全解析
已经有0人回复
-
Fexaramine：肠道限制性FXR化学探针，结构特征与信号通路研究全解析
已经有0人回复
-
NVS-STG2：靶向STING跨膜域的分子胶类激动剂，结构特征与寡聚化机制研究全解析
已经有0人回复
-
DOTA-GPC3肽（CAS 3066439-94-6）：双功能分子探针前体的结构特征与标记应用解析
已经有0人回复
-
科研用 TLR7/8 双激动剂怎么选？现货与质控要点
已经有0人回复
-
SEL120-34A HCl：CDK8/CDK19高选择性激酶抑制剂
已经有0人回复
dragonhmw
铁杆木虫 (正式写手)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 10595.7
- 散金: 65
- 红花: 40
- 帖子: 843
- 在线: 351.4小时
- 虫号: 1565043
- 注册: 2012-01-05
- 性别: GG
- 专业: 兽医传染病学
2楼2016-03-06 07:24:03
fudan671
木虫 (著名写手)
- 应助: 3 (幼儿园)
- 金币: 2149.1
- 散金: 335
- 红花: 7
- 帖子: 1343
- 在线: 45小时
- 虫号: 4075866
- 注册: 2015-09-16
- 性别: GG
- 专业: 微生物学
3楼2016-03-06 07:43:36
yilberg
新虫 (小有名气)
- 应助: 1 (幼儿园)
- 金币: 851.7
- 散金: 61
- 帖子: 71
- 在线: 8.2小时
- 虫号: 3433143
- 注册: 2014-09-22
- 性别: GG
- 专业: 生物物理、生物化学与分子
4楼2016-03-06 08:38:41
jackyoung
新虫 (正式写手)
- 应助: 9 (幼儿园)
- 金币: 3507.7
- 散金: 60
- 红花: 23
- 帖子: 670
- 在线: 91.7小时
- 虫号: 799178
- 注册: 2009-06-26
- 性别: GG
- 专业: 园艺学与植物营养学
5楼2016-03-06 08:45:55
hanxiaominhu
至尊木虫 (著名写手)
- 应助: 126 (高中生)
- 金币: 25800.4
- 散金: 127
- 红花: 14
- 帖子: 2979
- 在线: 846.9小时
- 虫号: 1526260
- 注册: 2011-12-06
- 性别: GG
- 专业: 生物化学
小胖芙芙6楼2016-03-06 08:46:12
张凡云
至尊木虫 (职业作家)
- 应助: 4 (幼儿园)
- 金币: 13433.9
- 散金: 3094
- 红花: 13
- 帖子: 4123
- 在线: 1488.1小时
- 虫号: 2426111
- 注册: 2013-04-19
- 专业: 生物物理、生物化学与分子
|
第一点，双峰的结果是不是你想要的结果？不是的话，麻烦你的引物重新设计，不够特异性，第二点，你可以用高保真酶就可以啊，La酶是长片段扩增用的吧？ 发自小木虫IOS客户端 |
» 本帖已获得的红花（最新10朵）
7楼2016-03-06 09:07:56
原海亮
木虫 (著名写手)
- 应助: 232 (大学生)
- 金币: 4607.4
- 散金: 3521
- 红花: 33
- 帖子: 1804
- 在线: 375.4小时
- 虫号: 1392705
- 注册: 2011-09-06
- 性别: GG
- 专业: 微生物生理与生物化学
【答案】应助回帖
感谢参与，应助指数 +1
|
不到200的片段用普通酶应该可以拿到正确的序列的，突变率还是比较低的，对于你测序是双峰，不知道你送测的样品是什么？测序结果一点正确的都没有？如果是PCR产物，建议将pcr产物进行胶回收或者过柱纯化后测序，另一个办法即将pcr产物连接到T载体测序。另外实验中不同的酶更换后，条件还是要重新摸索的，特别退火温度，因为经常会出现普通酶可以而高保真的酶不行。我不太清楚第二种酶的延伸速度，不到200的片段应该不用那么长延伸时间吧，循环数也适当减少些，祝好！ 发自小木虫Android客户端 |
» 本帖已获得的红花（最新10朵）
8楼2016-03-06 09:12:52
|
溶液体系是: LA Taq 0.25微升 pcr buffer 2.5微升 dNTP Mix 2微升 primers 1/1微升 ddH2O 17.25微升 DNA 1微升 对了，LA taq是125U的 发自小木虫Android客户端 |
9楼2016-03-06 10:06:20
10楼2016-03-06 10:16:41
50