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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 求助！！短片段（169 bp）PCR扩增，用Takara La Taq酶，不出条带呀。。。。
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小胖芙芙

新虫 (初入文坛)

[求助] 求助！！短片段（169 bp）PCR扩增，用Takara La Taq酶，不出条带呀。。。。 已有5人参与

小白第一次发帖，各位大神见谅。。。。
以前用普通的2×Taq PCR Mix扩增，它含的酶是Taq DNA Polymerase，扩增条带是169 bp，当时可以出条带，亮度可以。也送测了的，返回结果有的位点是双峰。
因为提的DNA是混合物，现在想做克隆看看混合物的成分，就换成了Takara的La taq，但是不出条带了呀。。。引物没变，PCR条件也没变。。。。
我的条件是这样的：
（1）94℃ 5min
（2）94℃ 30s
（3）51 ℃ 30s
（4）72℃ 45s
（5）（2）-（4）39
（6）72℃ 10min
（7）4℃ forever
求各位大神帮帮忙，看看有没有啥问题啊。。。。
有啥没说到的，各位大神尽管问。。。。。
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1楼 2016-03-06 00:06:02
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dragonhmw

铁杆木虫 (正式写手)
不应该啊，溶液体系是什么？

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2楼2016-03-06 07:24:03
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fudan671

木虫 (著名写手)
重新摸索条件，怀疑da降解

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3楼2016-03-06 07:43:36
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yilberg

新虫 (小有名气)
循环降数一下试试

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4楼2016-03-06 08:38:41
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jackyoung

新虫 (正式写手)
重新摸索条件是正道，这么点儿的片段用LA Taq有点儿浪费了。Anyway,最忌讳这种一个条件P到底的情况。

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CestLaVie
5楼2016-03-06 08:45:55
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hanxiaominhu

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
片段那么短，就用那个mix也行，保真性一般也行了，多送一两个测序就好了。La Taq不是用于长片段的吗（我忘了）。还有你的延伸时间可以缩短，有20s足够了，补充延伸也要缩短，40个循环是不是太多了。
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小胖芙芙
6楼2016-03-06 08:46:12
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张凡云

至尊木虫 (职业作家)
第一点，双峰的结果是不是你想要的结果？不是的话，麻烦你的引物重新设计，不够特异性，第二点，你可以用高保真酶就可以啊，La酶是长片段扩增用的吧？

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小胖芙芙
7楼2016-03-06 09:07:56
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原海亮

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
不到200的片段用普通酶应该可以拿到正确的序列的，突变率还是比较低的，对于你测序是双峰，不知道你送测的样品是什么？测序结果一点正确的都没有？如果是PCR产物，建议将pcr产物进行胶回收或者过柱纯化后测序，另一个办法即将pcr产物连接到T载体测序。另外实验中不同的酶更换后，条件还是要重新摸索的，特别退火温度，因为经常会出现普通酶可以而高保真的酶不行。我不太清楚第二种酶的延伸速度，不到200的片段应该不用那么长延伸时间吧，循环数也适当减少些，祝好！

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小胖芙芙
天空才是极限，我有信心飞的更高！
8楼2016-03-06 09:12:52
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小胖芙芙

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by dragonhmw at 2016-03-06 07:24:03
不应该啊，溶液体系是什么？

溶液体系是:
LA Taq 0.25微升
pcr buffer 2.5微升
dNTP Mix 2微升
primers    1/1微升
ddH2O     17.25微升
DNA  1微升


对了，LA taq是125U的

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9楼2016-03-06 10:06:20
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小胖芙芙

新虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
6楼: Originally posted by hanxiaominhu at 2016-03-06 08:46:12
片段那么短，就用那个mix也行，保真性一般也行了，多送一两个测序就好了。La Taq不是用于长片段的吗（我忘了）。还有你的延伸时间可以缩短，有20s足够了，补充延伸也要缩短，40个循环是不是太多了。

开始想的是用LA就可以不用单独加A尾了，它确实是扩长的，以前用它扩过500bp的片段是没有问题的。循环数我也试着降一下吧，谢谢。。

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10楼2016-03-06 10:16:41
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