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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 染色体步移
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faile18

金虫 (小有名气)

[求助] 染色体步移 已有1人参与

目前在利用takara的genome walking试剂盒克隆玉米中一段启动子序列，第一次利用AP1-4的时候均得到了1.3kb的产物，设计特异引物克隆这一段，已经测序得到这一段序列。在此基础上进行第二次walking，第三轮的GSP设计在距离第一次1.3kb 5‘端140bp的位置，这次AP1,3，4得到的产物相似，AP2得到产物略小约900bp，然后设计一对引物可以检测出上面提到的140bp进行初筛，结果只有AP2中所有克隆都含有这一段，克隆、测序、BLAST比对，900bp可以比对到染色体上相应位置，并且与第一次的1.3kb可以重合。拼接后得到约2.0kb的区段，只需要对1.7kb的区段进行研究，设计引物扩增，在玉米B73中克隆到目的条带，但是未知材料里没有任何产物。请教一下各位，这是什么情况？明明两轮WALKING得到的产物可以拼接上而且在未知材料中得到的1.7kb也可以比对到染色体上相应位置，但是扩增不出来，其中的1.3kb已经得到证实，PCR体系及条件没有问题，求解。
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1楼 2016-01-22 10:22:31
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

dushangyun

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

想问问您的PCR循环的程序，跪求！
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经不住逝水流年，逃不过此间少年
4楼2016-03-14 18:40:55
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jingyu90217

新虫 (小有名气)
你好  我也在做染色体步移  也是takara的试剂盒  我第一次已得到1164bp

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6楼2016-04-14 01:56:40
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普通回帖

反应链

新虫 (正式写手)
InDel
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2楼2016-01-22 11:29:53
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faile18

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 反应链 at 2016-01-22 11:29:53
InDel

克隆用的引物是根据测序结果设计的，即使有InDel，也应该会有条带吧？
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3楼2016-01-22 12:34:44
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yali002

新虫 (初入文坛)
楼主 请问  你回收的第3次染色体步移产物的片段有没有要求？一定要比第2次的产物分子量小么？
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5楼2016-04-12 17:41:21
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jingyu90217

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by jingyu90217 at 2016-04-14 01:56:40
你好  我也在做染色体步移  也是takara的试剂盒  我第一次已得到1164bp

但是后面第二次步移回收第二轮的产物就一直连不上t载体。测序要不是空载要不就只能找到引物序列 无重叠区。真是要疯了……折腾很久了……要怎么改进一下呢？
染色体步移



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7楼2016-04-14 02:01:48
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bbaa5252

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by jingyu90217 at 2016-04-14 02:01:48
但是后面第二次步移回收第二轮的产物就一直连不上t载体。测序要不是空载要不就只能找到引物序列 无重叠区。真是要疯了……折腾很久了……要怎么改进一下呢？

...

你好，我最近也在做这个实验，我想问一下我为什么我2nd和3rd的扩增片段超过10000bp啊，感觉离点样孔很近，不知道是什么原因
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8楼2016-10-19 18:57:53
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renyi2015

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by jingyu90217 at 2016-04-14 01:56:40
你好  我也在做染色体步移  也是takara的试剂盒  我第一次已得到1164bp

你好，实验成功了吗？这个试剂盒多少钱啊

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9楼2016-10-29 11:34:32
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胡奎0925

木虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by renyi2015 at 2016-10-29 11:34:32
你好，实验成功了吗？这个试剂盒多少钱啊
...

1000+
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宁愿被误会，坚决不解释
10楼2017-05-08 09:29:30
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