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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 荧光定量PCR实验数据求助
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取个什么名啊

木虫 (正式写手)

[求助] 荧光定量PCR实验数据求助 已有1人参与

我分别用目的基因与内参基因及阴性对照做了荧光定量的预实验，结果如下图，用了两对引物，第三附图中前一个峰是目的基因，后一个峰是内参基因的，这样的实验结果能用吗？

荧光定量PCR实验数据求助
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荧光定量PCR实验数据求助-1
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荧光定量PCR实验数据求助-2
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1楼 2015-12-22 14:04:39
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

足下客

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

内参基因的Ct值要比目的基因的Ct值大，否则会对目的基因的扩增产生很大的影响。目的基因的浓度最高控制在Ct20左右，内参基因在扩增正常的情况下，Ct值要尽可能大，一般我们是调到Ct31左右。
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5楼2015-12-23 09:13:21
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足下客

木虫 (正式写手)
引用回帖:
15楼: Originally posted by 取个什么名啊 at 2015-12-24 08:39:06
我内参基因与目的基因都是用的CDNA，用的是宝生物的试剂盒，...

按照试剂盒的说明书操作一般是没问题的。建议你先不加内参基因的引物，只扩增目的基因看看，是否目的基因的扩增正常。内参基因和目的基因不能用相同的cDNA。那样就失去内参的意义了。对于内参的选择标准你得搞明白，要比目的基因的扩增效率低，而且荧光增峰也要比目的基因低。  你这个实验可能要重新设计了，你最好是问一下做过的师兄师姐，因为我不知道具体情况，所以也没法细说。
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16楼2015-12-24 08:45:48
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足下客

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
看你第一幅图的扩增曲线，第一条曲线的Ct值那么靠前，显然是不对的。而且你的内参基因的扩增荧光增峰值怎么会那么低，整个扩增就有问题
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取个什么名啊
2楼2015-12-22 15:54:41
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取个什么名啊

木虫 (正式写手)
送红花一朵
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2楼: Originally posted by 足下客 at 2015-12-22 15:54:41
看你第一幅图的扩增曲线，第一条曲线的Ct值那么靠前，显然是不对的。而且你的内参基因的扩增荧光增峰值怎么会那么低，整个扩增就有问题

第一条曲线的CT值是内参的。关于扩增荧光峰值，你做的是多少，内参的CT值怎么处理。求帮助
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3楼2015-12-22 19:27:00
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足下客

木虫 (正式写手)
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3楼: Originally posted by 取个什么名啊 at 2015-12-22 19:27:00
第一条曲线的CT值是内参的。关于扩增荧光峰值，你做的是多少，内参的CT值怎么处理。求帮助...

Ct值我们一般都是在18以后，内参的浓度你自己要控制好，如果浓度很高，你要先用TE稀释。荧光增峰我们一般至少在1000-2000，大部分情况都在2500左右。不知道你扩的是DNA还是RNA，你的反应体系可能有问题
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4楼2015-12-23 09:10:35
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足下客

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

你可以看一下我扩增的这张图，蓝色的线是目的基因的，我是做了一个梯度的。绿色的线是内参基因的，我这个内参基因的荧光增峰比较低，只有1000，还需要调整。
荧光定量PCR实验数据求助-3
1.png
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6楼2015-12-23 09:18:21
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取个什么名啊

木虫 (正式写手)
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4楼: Originally posted by 足下客 at 2015-12-23 09:10:35
Ct值我们一般都是在18以后，内参的浓度你自己要控制好，如果浓度很高，你要先用TE稀释。荧光增峰我们一般至少在1000-2000，大部分情况都在2500左右。不知道你扩的是DNA还是RNA，你的反应体系可能有问题...

我扩的是CDNA,体系是sybr  12.5,CDNA 2微升，引物各一微升，补足至25微升，依你看我的体系有什么问题，或者有什么建议？谢谢

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7楼2015-12-23 14:28:39
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取个什么名啊

木虫 (正式写手)
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7楼: Originally posted by 取个什么名啊 at 2015-12-23 14:28:39
我扩的是CDNA,体系是sybr  12.5,CDNA 2微升，引物各一微升，补足至25微升，依你看我的体系有什么问题，或者有什么建议？谢谢
...

40个循环

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8楼2015-12-23 14:29:44
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足下客

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by 取个什么名啊 at 2015-12-23 14:28:39
我扩的是CDNA,体系是sybr  12.5,CDNA 2微升，引物各一微升，补足至25微升，依你看我的体系有什么问题，或者有什么建议？谢谢
...

哦，你用的是染料法，我们都是用TaqMan探针。你预实验做过吗？跑普通PCR，电泳条带怎么样？Tm值是多少？目的基因和内参基因有多少bp?
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9楼2015-12-23 14:51:21
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取个什么名啊

木虫 (正式写手)
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9楼: Originally posted by 足下客 at 2015-12-23 14:51:21
哦，你用的是染料法，我们都是用TaqMan探针。你预实验做过吗？跑普通PCR，电泳条带怎么样？Tm值是多少？目的基因和内参基因有多少bp?...

普通pcr是单带，退火温度都是54度
荧光定量PCR实验数据求助-4



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10楼2015-12-23 15:03:40
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