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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 荧光定量PCR实验数据求助
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取个什么名啊

木虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 足下客 at 2015-12-23 14:51:21
哦，你用的是染料法，我们都是用TaqMan探针。你预实验做过吗？跑普通PCR，电泳条带怎么样？Tm值是多少？目的基因和内参基因有多少bp?...

目的基因150bp,内参300bp

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11楼2015-12-23 15:04:14
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足下客

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

退火温度有些低了，一般荧光PCR的退火温度要在58度以上。看你这个条带浓度很正常啊，不应该荧光增峰那么低的。你看看染料的说明书，是不是染料加少了？好多年没做染料法了，我也记不清加多少了。不同牌子的加的量应该不一样的。
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12楼2015-12-23 15:36:17
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足下客

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

建议你加大cDNA的用量，增至5微升看看。先不加内参基因的引物看看扩增情况。
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13楼2015-12-23 15:38:59
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足下客

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

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取个什么名啊: 金币+100, ★★★★★最佳答案 2015-12-24 08:37:30
再就是你的内参基因是不是和目的基因在一个模板上？内参基因一般都是用人工构建的质粒，这样方便调节浓度。如果和目的基因在一个模板上，内参基因没法调整浓度。一般内参质粒原液要用TE至少稀释10000倍以上
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14楼2015-12-23 15:41:12
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取个什么名啊

木虫 (正式写手)
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14楼: Originally posted by 足下客 at 2015-12-23 15:41:12
再就是你的内参基因是不是和目的基因在一个模板上？内参基因一般都是用人工构建的质粒，这样方便调节浓度。如果和目的基因在一个模板上，内参基因没法调整浓度。一般内参质粒原液要用TE至少稀释10000倍以上

我内参基因与目的基因都是用的CDNA，用的是宝生物的试剂盒，
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15楼2015-12-24 08:39:06
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足下客

木虫 (正式写手)
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15楼: Originally posted by 取个什么名啊 at 2015-12-24 08:39:06
我内参基因与目的基因都是用的CDNA，用的是宝生物的试剂盒，...

按照试剂盒的说明书操作一般是没问题的。建议你先不加内参基因的引物，只扩增目的基因看看，是否目的基因的扩增正常。内参基因和目的基因不能用相同的cDNA。那样就失去内参的意义了。对于内参的选择标准你得搞明白，要比目的基因的扩增效率低，而且荧光增峰也要比目的基因低。  你这个实验可能要重新设计了，你最好是问一下做过的师兄师姐，因为我不知道具体情况，所以也没法细说。
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16楼2015-12-24 08:45:48
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足下客

木虫 (正式写手)
最好是重新设计引物，引物的Tm值在58度以上。内参不要用cDNA。
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17楼2015-12-24 08:47:11
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取个什么名啊

木虫 (正式写手)
引用回帖:
17楼: Originally posted by 足下客 at 2015-12-24 08:47:11
最好是重新设计引物，引物的Tm值在58度以上。内参不要用cDNA。

内参基因用什么模板，我的师姐是做发酵的，我做分子，都得自己想，万分感谢你帮助我

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18楼2015-12-24 10:50:59
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足下客

木虫 (正式写手)
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18楼: Originally posted by 取个什么名啊 at 2015-12-24 10:50:59
内参基因用什么模板，我的师姐是做发酵的，我做分子，都得自己想，万分感谢你帮助我
...

内参我们是用的人工合成的质粒，可以把你的内参基因连接到载体上，然后转大肠，挑单克隆，提取质粒。测一下质粒浓度，再稀释，就可以作为内参了，跟目的基因的模板一起加入反应溶液中，内参加的量很少，25微升体系，最多加1微升。如果实验室有钱，直接让公司人工合成质粒即可。这块我也不是特别懂，大概是这个流程。
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19楼2015-12-24 11:57:31
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取个什么名啊

木虫 (正式写手)
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19楼: Originally posted by 足下客 at 2015-12-24 11:57:31
内参我们是用的人工合成的质粒，可以把你的内参基因连接到载体上，然后转大肠，挑单克隆，提取质粒。测一下质粒浓度，再稀释，就可以作为内参了，跟目的基因的模板一起加入反应溶液中，内参加的量很少，25微升体系 ...

你是内参基因的引物和目的基因的引物加在同一管中吗

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20楼2015-12-24 12:07:03
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