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取个什么名啊

木虫 (正式写手)

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9楼: Originally posted by 足下客 at 2015-12-23 14:51:21
哦,你用的是染料法,我们都是用TaqMan探针。你预实验做过吗?跑普通PCR,电泳条带怎么样?Tm值是多少?目的基因和内参基因有多少bp?...

目的基因150bp,内参300bp

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11楼2015-12-23 15:04:14
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足下客

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

退火温度有些低了,一般荧光PCR的退火温度要在58度以上。看你这个条带浓度很正常啊,不应该荧光增峰那么低的。你看看染料的说明书,是不是染料加少了?好多年没做染料法了,我也记不清加多少了。不同牌子的加的量应该不一样的。
12楼2015-12-23 15:36:17
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足下客

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

建议你加大cDNA的用量,增至5微升看看。先不加内参基因的引物看看扩增情况。
13楼2015-12-23 15:38:59
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足下客

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

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取个什么名啊: 金币+100, ★★★★★最佳答案 2015-12-24 08:37:30
再就是你的内参基因是不是和目的基因在一个模板上?内参基因一般都是用人工构建的质粒,这样方便调节浓度。如果和目的基因在一个模板上,内参基因没法调整浓度。一般内参质粒原液要用TE至少稀释10000倍以上
14楼2015-12-23 15:41:12
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取个什么名啊

木虫 (正式写手)

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14楼: Originally posted by 足下客 at 2015-12-23 15:41:12
再就是你的内参基因是不是和目的基因在一个模板上?内参基因一般都是用人工构建的质粒,这样方便调节浓度。如果和目的基因在一个模板上,内参基因没法调整浓度。一般内参质粒原液要用TE至少稀释10000倍以上

我内参基因与目的基因都是用的CDNA,用的是宝生物的试剂盒,
15楼2015-12-24 08:39:06
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足下客

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15楼: Originally posted by 取个什么名啊 at 2015-12-24 08:39:06
我内参基因与目的基因都是用的CDNA,用的是宝生物的试剂盒,...

按照试剂盒的说明书操作一般是没问题的。建议你先不加内参基因的引物,只扩增目的基因看看,是否目的基因的扩增正常。内参基因和目的基因不能用相同的cDNA。那样就失去内参的意义了。对于内参的选择标准你得搞明白,要比目的基因的扩增效率低,而且荧光增峰也要比目的基因低。  你这个实验可能要重新设计了,你最好是问一下做过的师兄师姐,因为我不知道具体情况,所以也没法细说。
16楼2015-12-24 08:45:48
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足下客

木虫 (正式写手)

最好是重新设计引物,引物的Tm值在58度以上。内参不要用cDNA。
17楼2015-12-24 08:47:11
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取个什么名啊

木虫 (正式写手)

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17楼: Originally posted by 足下客 at 2015-12-24 08:47:11
最好是重新设计引物,引物的Tm值在58度以上。内参不要用cDNA。

内参基因用什么模板,我的师姐是做发酵的,我做分子,都得自己想,万分感谢你帮助我

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18楼2015-12-24 10:50:59
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足下客

木虫 (正式写手)

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18楼: Originally posted by 取个什么名啊 at 2015-12-24 10:50:59
内参基因用什么模板,我的师姐是做发酵的,我做分子,都得自己想,万分感谢你帮助我
...

内参我们是用的人工合成的质粒,可以把你的内参基因连接到载体上,然后转大肠,挑单克隆,提取质粒。测一下质粒浓度,再稀释,就可以作为内参了,跟目的基因的模板一起加入反应溶液中,内参加的量很少,25微升体系,最多加1微升。如果实验室有钱,直接让公司人工合成质粒即可。这块我也不是特别懂,大概是这个流程。
19楼2015-12-24 11:57:31
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取个什么名啊

木虫 (正式写手)

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19楼: Originally posted by 足下客 at 2015-12-24 11:57:31
内参我们是用的人工合成的质粒,可以把你的内参基因连接到载体上,然后转大肠,挑单克隆,提取质粒。测一下质粒浓度,再稀释,就可以作为内参了,跟目的基因的模板一起加入反应溶液中,内参加的量很少,25微升体系 ...

你是内参基因的引物和目的基因的引物加在同一管中吗

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20楼2015-12-24 12:07:03
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