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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 一个导致我做了20次PCR也没找到的问题
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areslhr

铁虫 (小有名气)

[交流] 一个导致我做了20次PCR也没找到的问题 已有29人参与

LZ 在国外访问，做昆虫线粒体基因组的。
提完模板之后，扩增最简单的COX1基因，胶图如下
一个导致我做了20次PCR也没找到的问题

之后为了增加样本量，又提了两次也还好。后来突然有一次就开始出现拖带，并且不再出现原条带。而12S 基因扩增的很好，条带十分清晰。 为了查明是哪部分原因。
做了很多次PCR，可谓心力交瘁。
1.用了三台机器，排除机器原因。 2.更换premix，更换水，重新配置引物，无效果。 3.两种模板均出现此情况 4.作为negative，以水替代DNA的对照也出现同样的拖带。 5。12S可以稳定扩增。如图。

一个导致我做了20次PCR也没找到的问题-1

今天换了一种新的模板作为对照，更加诡异。拖带和条带同时存在，而原模板和水仍然无条带，仅有拖带。

一个导致我做了20次PCR也没找到的问题-2

我最不理解为什么新换的水里也有拖带，如有高手指教，不胜感激。

对不起我只有4.5个金币，还不能悬赏。

一个导致我做了20次PCR也没找到的问题-3
1.jpg


一个导致我做了20次PCR也没找到的问题-4
2.jpg


一个导致我做了20次PCR也没找到的问题-5
601800125818983966.jpg
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Stop and stare
1楼 2015-12-18 20:07:29
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

匿名

用户注销 (正式写手)
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-01-13 22:52:40
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3楼2015-12-19 02:03:12
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glove94

木虫 (小有名气)
★ ★
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-01-13 22:52:54
maker没有拖带，胶和缓冲液应该是没有问题的

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2楼2015-12-19 00:51:44
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stephenreal

至尊木虫 (职业作家)
★ ★
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-01-13 22:53:09
与其重复这么多次，不如一次多做几个对照，就那么几种成分，缺酶的、缺DNTP、缺引物的，甚至加管儿纯水，stepwise吧。
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21楼2015-12-22 05:17:54
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梦幻小豚豚

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我做实验也出现过拖带，也是各种更换，你配胶的染色剂更换过吗？还有就是胶浓度。我也是新手，不是很懂，你好好加油。总会解决的。
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13楼2015-12-20 10:18:51
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WAX2010

银虫 (小有名气)
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-01-13 22:53:25
我之前也出现过拖带的现象，是因为胶回收之后，再次PCR加入的模板量太高，降低了模板量之后就解决了，或者可能是因为胶回收产物中的某些试剂影响了PCR反应。
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大手牵小手
20楼2015-12-22 04:03:54
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普通回帖

areslhr

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by glove94 at 2015-12-19 00:51:44
maker没有拖带，胶和缓冲液应该是没有问题的

哎、是啊..我不知道怎么办好了
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Stop and stare
4楼2015-12-19 18:39:43
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areslhr

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by becklittle at 2015-12-19 02:03:12
pcr的污染就是这么神奇。，无论把试剂怎么换都不行。可能污染源在枪在桌子在空气里。尤其是和质粒实验共用的地方
试试换个实验室做，看看是不是就正常了

除了枪我想不出来了，桌子每次都有UV灭菌。
如果枪污染的话，12S基因不知道可以跑出来很好的条带。
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Stop and stare
5楼2015-12-19 18:40:49
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陈爱中

新虫 (小有名气)
★
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引物二聚体都没得，pcr反应都没正常进行吧！

自己把试剂和pcr反应程序的温度设置好好看看。
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6楼2015-12-19 20:18:32
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Niliria

木虫 (小有名气)
水居然也有

发自小木虫Android客户端
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7楼2015-12-19 20:51:36
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baichi121234

禁虫 (职业作家)
本帖内容被屏蔽
8楼2015-12-19 21:01:11
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陈天龙2010

金虫 (著名写手)
★
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问题应该在模板上。

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无始无终
9楼2015-12-19 21:04:57
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likelich

木虫 (小有名气)
★
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应该有外源dna污染 考虑清洁实验室或者使用dnaoff类试剂处理实验器具

发自小木虫Android客户端
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10楼2015-12-19 22:58:00
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