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Mingle_Su

银虫 (小有名气)

[求助] CoIP/蛋白互作|| 阴性对照杂出条带 ||FLAG HA Triton 洗涤 原生质体瞬时表达已有2人参与

阴性对照的也被沉淀下来了,一周的实验就这样废了,请各位资深朋友帮分析下原因。每个样品用了20ul带FLAG抗体的磁珠(sigma),孵育结合后用0.1%的Triton 100 洗涤4次,最后用50mM的Tris-HCl pH=7.5 洗涤,每次洗涤均用1mL的buffer。个人觉得应该不是珠子没洗干净,另外考虑蛋白直接结合磁珠,两个完全不相关的蛋白都可以结合磁珠更加不可能。只能想到以上两个比较直接原因,请各位高手指教。 具体问题见下图,谢谢!

CoIP/蛋白互作|| 阴性对照杂出条带 ||FLAG HA Triton 洗涤 原生质体瞬时表达
CoIP
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Succeed
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Mingle_Su

银虫 (小有名气)

引用回帖:
11楼: Originally posted by 十比 at 2015-12-14 13:01:33
说明两个蛋白可能本身就没有互作,出现的条带可能是本底,你减少曝光时间HA条带可能就看不到了。

E9-HA几秒钟就爆出来,其实我也怀疑到底有没有互做,有的话拉下来的条带应该亮很多。
Succeed
13楼2015-12-15 23:11:36
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陈爱中

新虫 (小有名气)

反正你都过表达的,为什么不直接做体外pull-down?
2楼2015-12-13 11:19:35
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mofashishe

铜虫 (小有名气)

e81那个样品和flag抗体有交叉反应?

发自小木虫Android客户端
3楼2015-12-13 11:37:54
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Mingle_Su

银虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 陈爱中 at 2015-12-13 11:19:35
反正你都过表达的,为什么不直接做体外pull-down?

原生质体过表达和原核过表达差挺多的。其实我同时在做酵母双杂交,BiFC 和共定位的实验,哈哈。
Succeed
4楼2015-12-13 13:32:07
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