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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物化学 » CoIP/蛋白互作|| 阴性对照杂出条带 ||FLAG HA Triton 洗涤 原生质体瞬时表达
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Mingle_Su

银虫 (小有名气)

[求助] CoIP/蛋白互作|| 阴性对照杂出条带 ||FLAG HA Triton 洗涤 原生质体瞬时表达 已有2人参与

阴性对照的也被沉淀下来了，一周的实验就这样废了，请各位资深朋友帮分析下原因。每个样品用了20ul带FLAG抗体的磁珠（sigma），孵育结合后用0.1%的Triton 100 洗涤4次，最后用50mM的Tris-HCl pH=7.5 洗涤，每次洗涤均用1mL的buffer。个人觉得应该不是珠子没洗干净，另外考虑蛋白直接结合磁珠，两个完全不相关的蛋白都可以结合磁珠更加不可能。只能想到以上两个比较直接原因，请各位高手指教。 具体问题见下图，谢谢！

CoIP/蛋白互作|| 阴性对照杂出条带 ||FLAG HA Triton 洗涤 原生质体瞬时表达
CoIP
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Succeed
1楼 2015-12-12 19:29:32
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

mofashishe

铜虫 (小有名气)
用结合ha的凝胶，还有你是不是把抗体搞错了啊。

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8楼2015-12-13 23:01:29
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普通回帖

陈爱中

新虫 (小有名气)
反正你都过表达的，为什么不直接做体外pull-down？
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2楼2015-12-13 11:19:35
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mofashishe

铜虫 (小有名气)
e81那个样品和flag抗体有交叉反应？

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3楼2015-12-13 11:37:54
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Mingle_Su

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 陈爱中 at 2015-12-13 11:19:35
反正你都过表达的，为什么不直接做体外pull-down？

原生质体过表达和原核过表达差挺多的。其实我同时在做酵母双杂交，BiFC 和共定位的实验，哈哈。
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Succeed
4楼2015-12-13 13:32:07
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Mingle_Su

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by mofashishe at 2015-12-13 11:37:54
e81那个样品和flag抗体有交叉反应？

E81 和 E9 算是两个独立的实验，都出现了同样的问题，交叉反应的可能性应该不大。
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Succeed
5楼2015-12-13 13:36:18
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mofashishe

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by Mingle_Su at 2015-12-13 13:36:18
E81 和 E9 算是两个独立的实验，都出现了同样的问题，交叉反应的可能性应该不大。...

换一种凝胶试试了没？有没做过重复实验啊？从提提质粒开始，

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6楼2015-12-13 14:30:38
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Mingle_Su

银虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by mofashishe at 2015-12-13 14:30:38
换一种凝胶试试了没？有没做过重复实验啊？从提提质粒开始，
...

正在准备重复，换种凝胶是指？谢谢。
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Succeed
7楼2015-12-13 17:17:10
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mofashishe

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by mofashishe at 2015-12-13 23:01:29
用结合ha的凝胶，还有你是不是把抗体搞错了啊。

你是不是把ha和flag两个抗体弄混了，你上下两个图换换结果就很好了

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Mingle_Su
9楼2015-12-13 23:03:10
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Mingle_Su

银虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
9楼: Originally posted by mofashishe at 2015-12-13 23:03:10
你是不是把ha和flag两个抗体弄混了，你上下两个图换换结果就很好了
...

我也想像你描述的那样但真的用错没有，FLAG的珠子是黑色的磁珠，HA的珠子是白色的没有磁性的。而且FLAG标签的蛋白在IP后明显富集了。。。
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Succeed
10楼2015-12-13 23:56:09
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