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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物化学 » RACE 反转录求助
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引路者

铜虫 (初入文坛)

[求助] RACE 反转录求助 已有1人参与

本人大三学生，等着实验结果写论文申请出国……
现在卡在RACE上。
提取的mRNA经过1%琼脂糖电泳检验，结果是有两条亮带，很少降解。
然后反转录上有以个问题：

隔壁实验室给的两个接头引物BOD（3‘端有GGG的）和AOLP（3’端有poly T的），然后用的反转录试剂盒是Promega的A5000
根据说明书，采用以下操作：
totalRNA   5μg
AOLP        1ug
无核苷酸水（试剂盒提供）   补全到5ul
70℃ 预变性（应该是这样的目的） 5 min后立即冰浴5 min，然后任意速度离心10 s（没有写出速度要求，通常用7500 rpm）
  
反应体系配制：
5X 的Reaction Buffer                                                                      40 ul
MgCl2   （听说Mg越多杂带越少。但是扩增的条带越不亮）           4 ul
PCR Nucleotide Mix                                                                        10 ul
RRI                                                                                                0.5 ul
反转录酶（GoScript Recerse Transcriptase）                                 10  ul
BDO                                                                                              1 ul
用提供的Water调制                  15 .0ul

冰上混合变性的RNA和反应体系
25℃  5min
42℃  1h
70℃  15min

现在问题是，隔壁实验室给的体系和我买的体系稍有不同，
他们用37℃（DNase Buffer、RQ DNase，RRI，RNA和水配制成体系）处理后用加 AOLP和stop solution   70℃孵育（ 终止延伸用，说让后来的BOD结合上去）
然后在进行第一链cNDA合成，这时候才加BDO。

不知道以我的那种方法来做能不能达到同样的效果。就在在反转录的时候在5‘端加上BDO序列。

求助求助！！！
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1楼 2015-11-02 12:08:31
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zhangyao7255

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
引路者: 金币+5, ★有帮助, 非常感谢，但是重点还没解决。 2015-11-04 16:52:31
理论上可以，但要注意BDO与AOLP的引物不一样
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2楼2015-11-02 15:04:40
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引路者

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhangyao7255 at 2015-11-02 15:04:40
理论上可以，但要注意BDO与AOLP的引物不一样

非常感谢，另求stop solution的作用…网上并没有在反转录时相关的资料。
有信心做下去了！
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3楼2015-11-02 22:40:52
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zhangyao7255

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 引路者 at 2015-11-02 22:40:52
非常感谢，另求stop solution的作用…网上并没有在反转录时相关的资料。
有信心做下去了！...

分子生物学中有很多种stop solution。 这是什么stop solution，至少要有个货号或者试剂盒名称吧。
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4楼2015-11-02 23:19:15
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引路者

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by zhangyao7255 at 2015-11-02 23:19:15
分子生物学中有很多种stop solution。 这是什么stop solution，至少要有个货号或者试剂盒名称吧。...

promega做race的试剂盒的终止液。因为试剂盒不同了，不知道做的调整对不对…
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5楼2015-11-03 22:40:26
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